楊貴軍 劉鼎闊 劉芳 李源 胡鵬程 林霖雨 管振國(guó)/天津市生物飼料添加劑企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 300383

針對(duì)奶牛乳房炎這一疾病，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了深入研究，但目前這一疾病仍舊是導(dǎo)致奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的疾病之一。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等病原微生物是造成奶牛乳房炎最為主要的病原體。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，乳酸鏈球菌素對(duì)奶牛乳房炎具有顯著的治療效果。同時(shí)，有研究表明，乳酸鏈球菌素在一定條件下對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制作用。

1 試驗(yàn)?zāi)康?/h2>

本試驗(yàn)旨在檢測(cè)改構(gòu)乳酸鏈球菌素在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌是否具有抗菌活性。

2 試驗(yàn)材料

2.1 菌株鏈球菌（Streptococcus）臨床菌株L 1473、L 4732、L 2348、L 2853、L 1463 和L 5321 與大腸桿菌分離株來(lái)自同樣的兩個(gè)奶牛場(chǎng)的乳房炎患牛；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 1717 和ATCC 29213：購(gòu) 自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection，ATCC）；臨床菌株S 1963、S3210、S1689 和S2425 與鏈球菌、大腸桿菌分離株來(lái)自同樣的兩個(gè)奶牛場(chǎng)的乳房炎患牛。大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 43895 和ATCC 43890：購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection，ATCC）；臨 床菌株EC3521、EC5632、EC3478 及EC2569大腸桿菌分離株：取自兩個(gè)奶牛場(chǎng)的乳房炎患牛。

2.2 儀器UV～2600 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海尤尼柯）；電子天平（深圳市恒志?？萍加邢薰荆?；8037～SVD 壓力蒸汽滅菌鍋（山東博科消毒設(shè)備有限公司）；THZ～82 恒溫?fù)u床（上海躍進(jìn)）；微量移液器（德國(guó)艾本德）；超凈工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱（哈爾濱東聯(lián)）；其它玻璃儀器（北京鼎國(guó)）。

2.3 藥品和試劑供試品：改構(gòu)乳酸鏈球菌素，由天津市生物飼料添加劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。效價(jià)：2000IU，經(jīng)檢驗(yàn)合格。

MH 肉湯培養(yǎng)基（MHB）（BD Biosciences）；二甲基亞砜（DMSO）（sigma）。

2.4 試驗(yàn)所需試劑的配制

（1）藥物配制：精確稱取改構(gòu)乳酸鏈球菌素，溶解于DMSO 中，配制成濃度為51200 μg/mL 的母液，備用。

（2）MHB 培養(yǎng)基：稱取MHB 粉末21.0 g，加熱溶解于1000mL 蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，備用。

3 試驗(yàn)方法

3.1 細(xì)菌培養(yǎng)取各受試菌的甘油保存液，以1∶100 接種到3～5mL 各自適宜的培養(yǎng)基中，置于37℃搖床中震蕩培養(yǎng)18～24 h，再劃線接種于瓊脂平板上，置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。挑取各平板上的單菌落，接種于液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，再次劃線接種于瓊脂平板上。生化培養(yǎng)箱中靜置過(guò)夜后，用封口膜密封，置于4℃環(huán)境保存。再次挑取各平板上的單菌落，接種于MHB 培養(yǎng)基中，置于37℃搖床中振蕩培養(yǎng)10～12 h 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600，用MHB 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)菌濃度至5×108CFUs/mL，待用。

3.2 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定取高壓滅菌后的試管置于超凈工作臺(tái)中，12 支試管為一行。每行第一支試管中加入1975 μL MHB 培養(yǎng)基，其余試管均加入1mL 培養(yǎng)基。然后于第1 個(gè)試管中加入改構(gòu)乳酸鏈球菌素儲(chǔ)備液25 μL，混勻后依次進(jìn)行倍比稀釋（藥物經(jīng)稀釋后DMSO 含量不超過(guò)1%），使得改構(gòu)乳酸鏈球菌素的濃度依次為512、256、128……1 μg/mL 共10 個(gè)濃度梯度。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。而最后一支為不加待測(cè)藥物的陰性對(duì)照。每支試管中加入5 μL 稀釋后的菌液，使得每支試管的菌液濃度為 5×105CFUs/ml。每組重復(fù)三次。將試管架置于生化培養(yǎng)箱中 37℃靜置培養(yǎng)12～24 h 后觀察，記錄結(jié)果。以沒(méi)有肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定取高壓滅菌后的試管置于超凈工作臺(tái)中，7 支試管為一行。每行第一支試管中加入濃度為16 MIC 改構(gòu)乳酸鏈球菌素，充分混勻后，依次2 倍稀釋至第五支試管。余下的試管一支為只加菌液的陰性對(duì)照，另一支為只有培養(yǎng)基的空白對(duì)照。加入5 μL 稀釋后的菌液，使得每支試管的菌液濃度為 5×105CFUs/ml。每組重復(fù)三次。將試管架置于生化培養(yǎng)箱中 37℃靜置培養(yǎng)12～24 h 后，分別用直徑4 mm 的接種環(huán)取一環(huán)樣液劃線接種于各自適宜的固體培養(yǎng)基上，于37℃孵育48 小時(shí)。觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度作為最小殺菌濃度。。

4 試驗(yàn)結(jié)果

4.1 改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌的最小抑菌濃度（MIC）本實(shí)驗(yàn)采用試管二倍稀釋法考察了改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)引起奶牛乳房炎的三大主要病原菌的抗菌活性。結(jié)果，改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)所測(cè)的6 株金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng)，其MIC 值在0.02～0.06 μg/mL 范圍之內(nèi)。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，即使金葡菌對(duì)其他抗生素具有不同的敏感性，但是對(duì)耐藥金葡菌（ATCC 1717）及不耐藥金葡菌（ATCC 29213）對(duì)改構(gòu)乳酸鏈球菌素的敏感性并未受此影響。并且，改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)臨床分離金葡菌的抑菌作用，與其對(duì)標(biāo)準(zhǔn)（耐藥和不耐藥）菌株的抑菌作用基本上在同一水平，均具有較強(qiáng)的抑菌性。本研究中改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)6 株鏈球菌的抑菌作用與其對(duì)金葡菌的抑菌作用水平相似，MIC 值范圍為0.04～0.06 μg/mL；改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)本研究所測(cè)的6 株大腸桿菌的MIC 值范圍為0.062～0.115 μg/mL。

4.2 改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌最小殺菌濃度（MBC）根據(jù)最小抑菌濃度，調(diào)整改構(gòu)乳酸鏈球菌素受試濃度。結(jié)果表明，改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)金黃色葡萄球菌、鏈球菌及大腸桿菌所試菌株的MBC 基本在MIC～4MIC之間。三種菌株的MBC 依次分別為0.04～0.16 μg/mL、0.09～0.15 μg/mL 及0.15～0.32 μg/mL。若依據(jù)細(xì)菌對(duì)所試藥物產(chǎn)生了耐藥性的MBC 標(biāo)準(zhǔn)為MBC≥32 MIC，則本試驗(yàn)中18 株試驗(yàn)菌株對(duì)改構(gòu)乳酸鏈球菌素均未產(chǎn)生耐藥性。

5 結(jié)論

分析藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)于金葡菌、鏈球菌和大腸桿菌的抑菌及殺菌作用較強(qiáng)。這一結(jié)果提示改構(gòu)乳酸鏈球菌素是一種潛在的可開發(fā)為抗奶牛乳房炎感染的新藥物。