黃博珅

（廣東華大法醫(yī)物證司法鑒定所，廣東 深圳）

0 引言

法醫(yī)物證學是以法醫(yī)物證為研究對象，以提供科學證據(jù)為目的，研究應(yīng)用生命科學技術(shù)解決案件中與人體有關(guān)的生物檢材鑒定的一門學科[1]；法醫(yī)物證鑒定，就是從生物檢材的角度，比對與案件有關(guān)的DNA進行個人識別和親子鑒定，是依據(jù)遺傳學理論，通過對DNA分子進行生物檢測，分析判斷個體生物學特征，為刑偵案件和司法實踐提供證據(jù)[2]。本文，通過對DNA技術(shù)的發(fā)展與實踐應(yīng)用的論述分析，探析DAN鑒定在法醫(yī)物證學中的實踐方法。

1 DnA鑒定技術(shù)分型

作為法醫(yī)物證學取證的重要方法，DNA鑒定技術(shù)包括DNA STR分型技術(shù)、minSTR技術(shù)、單核苷酸多態(tài)分型技術(shù)、線粒體DNA等，是目前廣泛應(yīng)用于法醫(yī)物證學中的鑒定方法，是包括刑事案件偵破、司法鑒定等進行科學取證的重要途徑[3]。

1.1 DnA STR分型

STR是存在于人類基因組DNA中的一類具有長度多態(tài)性的DNA序列，其多態(tài)性成為法醫(yī)物證檢驗個人識別和親子鑒定的豐富來源；分析STR位點的多態(tài)性，已成為法醫(yī)學上個體識別和親子鑒定主要技術(shù)方法。該技術(shù)是通過對毛發(fā)、血痕、精斑、人體組織或白骨等生物學樣本進行DNA提取，通過限制性核酸內(nèi)切酶酶切、電泳分離和同位素標記的重復(fù)DNA雜交，對每個個體特異的放射自顯影帶型進行分析鑒別[4]。STR分型檢測方法包括銀染法和熒光法，熒光自動分析法進行STR位點分型具有用時少、靈敏度和準確率高等優(yōu)點，已經(jīng)成為STR分型的主要方法；但該方法對設(shè)備和試劑要求較高、費用昂貴，也是制約該方法廣泛應(yīng)用的缺點。

1.2 minSTR技術(shù)

minSTR技術(shù)主要應(yīng)用于對微量生物組織或者生物組織已經(jīng)出現(xiàn)嚴重降解時的檢測，主要用于對常規(guī)STR基因座檢測的補充；該檢測方法通過減少的STR位點增多片斷進行檢測，一般只需使片斷維持在100bp即可獲得較理想的檢測結(jié)果、提高等位基因的檢出率。但該檢測方法只能將少部分基因座增擴，STR分型結(jié)果可由于minSTR引物與過去引物結(jié)合大量堿基缺少或插入而存在差異，因此存在著實際應(yīng)用中的局限[5]。

1.3 單核苷酸多態(tài)性分析

單核苷酸多態(tài)性分析（single nucleotide polymorphisms，SNP）是基因組上單個核苷酸變異形成的遺傳標記，具有多態(tài)性豐富、數(shù)量多的特點，廣泛地存在于人類基因組中，是可遺傳變異中最常見的一種。人體的表型差異及對藥物或疾病的易感性均與SNP相關(guān)，因此SNP成為第三代遺傳標志，廣泛應(yīng)用于高危群體發(fā)現(xiàn)、疾病相關(guān)基因鑒定、藥物設(shè)計測試等；法醫(yī)證物學中，SNP技術(shù)主要用于群體災(zāi)難中的個體檢驗判斷。目前的SNPs檢驗技術(shù)主要包括變性梯度凝膠電凝、引物延伸技術(shù)與飛行時間質(zhì)譜技術(shù)等，但種類SNP檢測技術(shù)均需要較為復(fù)雜的設(shè)備，致使該技術(shù)在法醫(yī)物證學中的應(yīng)用受限于相關(guān)設(shè)備制造和研發(fā)，需要依賴相關(guān)設(shè)備、儀器的發(fā)展而逐步推廣應(yīng)用[6]。

1.4 線粒體DnA

線粒體DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）是線粒體中的遺傳物質(zhì)，是在細胞線粒體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的脫氧核糖核酸特殊形態(tài)，一個線粒體中一般有多個DNA分子；線粒體主要通過卵細胞傳遞，以母系遺傳為主要遺傳形式。mtDNA所有基因位于一個單一環(huán)狀DNA分子，遺傳物質(zhì)不為核膜包被、不為蛋白質(zhì)壓縮，一些堿基為重疊基因，其存活時間長、不易降解，因此適用于確認家庭關(guān)系，法醫(yī)物證學中主要應(yīng)用該方法進行微量或缺乏核DNA的檢測。但線粒體DNA檢測中，線粒體DNA具有異質(zhì)性，會出現(xiàn)兩種或兩種以上類型的對mtDNA，因此在法醫(yī)物證學應(yīng)用該方法進行親子鑒定時，應(yīng)針對其穩(wěn)定性差的特點，對鑒定結(jié)果需要進一步證實[7]。

2 多位點DnA指紋技術(shù)

多位點DNA指紋技術(shù)是指利用個體特異的DNA多態(tài)性，同人體核DNA的酶切片段雜交、獲得多個位點的等位基因組成的、長度不等的雜交帶圖紋，以進行個體識別及親子鑒定，因該圖紋的重復(fù)率極低、識別力高，甚至超過手指指紋的個體識別能力，因而稱為多位點DNA指紋。

多位點DNA指紋分析運用DNA指紋圖譜分析方法多樣，包括RFLP（限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性）分析、串聯(lián)重復(fù)序列分析、RAPD（隨機擴增多態(tài)性DNA）分析等；檢驗檢測材料多樣，包括精液、陰道分泌物、血液、毛發(fā)等各種核細胞，且該檢測方法操作復(fù)雜、每個環(huán)節(jié)的操作均對檢測結(jié)果的準確性具有影響[8]，因此對各個環(huán)節(jié)的操作都有較高的要求：（1）對檢測材料，要求其中要有足量的高分子量DNA、且比值需在1.8左右；而在進行提取操作時，應(yīng)嚴格按照相關(guān)操作規(guī)范實施，避免因動作過大使DNA大分子斷裂。（2）在進行限制性內(nèi)切酶消化DNA操作時，需要嚴格按照標準操作流程進行操作，對酶和樣品、緩沖液體應(yīng)充分混勻；甘油濃度要控制在5%以下，以避免因不當操作而導(dǎo)致污染DNA、令DNA被剪切、或者出現(xiàn)抑制酶解等，出現(xiàn)DNA指標圖譜錯誤。（3）在實施DNA瓊脂凝膠電泳分離操作時，應(yīng)確保凝膠板膠厚小于4mm，并將凝膠板在4℃冰箱內(nèi)放置30min；當電泳高于室內(nèi)溫度時，可提高降低電壓、電流，適當延長電泳時間，以避免因熱量散發(fā)不及時而導(dǎo)致凝膠變形、使電泳遷移頻率加快，降低分離效果。（4）要保證真空轉(zhuǎn)移的高效、高速，在清除膠布底泡沫時，必須確保動作輕緩，防止轉(zhuǎn)移和清除動作過大而使譜帶變形。（5）在采取非同位素探針標記時，應(yīng)將探針溶液稀釋，在熱變性5min后放入冰浴中，并用等體積標記試劑，放入全部物質(zhì)并充分總合，做好水浴反應(yīng)，以確保標記效率和雜交成功率。（6）非同位素雜交膜洗脫過程中，要針對背景清晰度，在更換溶液時，每次均使用濾紙吸收干凈濾膜；沖洗X線片操作過程中，顯影液使用次數(shù)水少于10次、存放時間需低于30d、顯影條件溫度為20℃。

例如在強奸案中使用DNA指紋圖檢驗，首選在現(xiàn)場提取檢驗材料，從檢驗材料中提取精子，如出現(xiàn)DNA酶解不開或酶無法完全解開，其主要原因包括以下幾個方面：DNA溶液濃度不準確或DNA用量過多，酶量過少；混合斑載體混入了面料、泥土等，使DNA中融入其他小分子，抑制酶從而導(dǎo)致酶解不開，此時應(yīng)將溶液充分搖勻，提高DNA量予以解決。進行同一樣品不同酶解時間檢驗時，不完全酶解與完全酶解的DNA樣品指紋圖譜具有一定差異，實際操作時需要準確挨近酶解時間，并隨DNA量增加適當延長時間，以保證酶解的有效率。

綜上，DNA鑒定技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展，為法醫(yī)物證學的實踐提供了一條重要途徑，也必將隨著自身技術(shù)的提升而進一步促進法醫(yī)物證學的發(fā)展而不斷完善。