曹春哲

（復(fù)旦大學(xué) 生物工程系，上海 200438）

體外診斷試劑（In-Vitro Diagnostic，簡稱IVD）的生產(chǎn)中，溶液均質(zhì)化是關(guān)鍵工藝步驟，決定試劑混合的均勻程度，并最終影響試劑的性能。

一般而言，混合時間定義為在混合容器中加入示蹤劑并達(dá)到一定均勻程度的時間[1]，工業(yè)通常使用95%均勻度記錄混合時間。Gabriel統(tǒng)計了近50年來的混合時間測定方法，大致上分為侵入式方法和非侵入式方法[2]，這兩類方法各自都有局限性，因此應(yīng)當(dāng)探索一種更為理想的混合時間測定方法，該方法應(yīng)當(dāng)既不影響流場狀態(tài)，又可用于非透明、體積較大的工業(yè)罐體，重復(fù)性好，測定終點易于判斷。

由于在IVD實際生產(chǎn)中主要使用水樣介質(zhì)，因此應(yīng)用水溶液檢查攪拌容器的混合性能?？紤]在非侵入式方法中，尋找加強(qiáng)的顏色變化反應(yīng)，使其可以應(yīng)用到非透明的反應(yīng)器中。比色法是確定混合時間的常用視覺方法，與使用傳感器進(jìn)行局部測量相反，可以直觀顯示整個容器內(nèi)容物的均質(zhì)特性。本研究擬建立一種更適用于工業(yè)規(guī)模的混合時間測定方法，并利用該法探索對于混合時間有影響的因素，測試現(xiàn)有攪拌設(shè)備的性能并優(yōu)化混合工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

碘、碘化鉀、淀粉和五水合硫代硫酸鈉均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；去離子水為羅氏診斷產(chǎn)品（蘇州）有限公司生產(chǎn)。

500 mL、1 000 mL量 筒，500 mL、1 000 mL、5 L燒杯，10 mL滴定管，VMR；5 L不銹鋼鍋、C21-WT2112T電磁爐，美的；RCT basic package 1電磁攪拌器，IKA；5 mL移液器，Eppendorf；2～8 ℃冰箱，MMM；Touchcontrol900 pH 計，Mettler Toledo；Touchcontrol900電導(dǎo)率儀，Mettler Toledo；Minebea Intec Maxxis 5電子天平，Sartorius。

1.2 溶液配制

1%淀粉溶液配制：10 g淀粉溶于200 mL去離子水中，攪拌均勻并倒入800 mL煮沸的去離子水中，煮沸后保持5 min并攪拌。淀粉溶液應(yīng)當(dāng)新鮮配制。

1 L I2-KI溶液配制：稱取250 g碘化鉀加入500 g去離子水配制碘化鉀溶液至完全溶解，再加入128 g碘單質(zhì)混合至完全溶解，最后加入去離子水至1 L并混合5 min以上。

1 L硫代硫酸鈉溶液配制：將248 g五水合硫代硫酸鈉直接加入500 g去離子水中，加水至1 L混合至完全溶解。

I2-KI溶液和硫代硫酸鈉溶液應(yīng)在2～8 ℃下避光保存。溶液配制無須精確使用容量瓶定容，且工業(yè)罐體測試所用溶液量較大，通常使用地磅或者天平稱重，關(guān)鍵參數(shù)為I2-KI溶液和硫代硫酸鈉溶液的滴定系數(shù)T，需要準(zhǔn)確測定。

1.3 比色法測定混合時間

在攪拌設(shè)備中加入體積為V的去離子水和體積為0.005 0V的淀粉溶液（VS），100 r/min以上混合5 min；加入體積為 0.000 4V 的 I2-KI溶液（VI），100 r/min以上混合5 min；加入適量Na2S2O3溶液（VN），并在完全加入后記錄時間t0，一旦顏色在整個容器中消失，就停止測試并記錄時間t1，根據(jù)公式（1）計算混合時間（tm）。該過程中，VN根據(jù)公式（2）計算。如果重復(fù)測試，則加入少許I2-KI溶液至攪拌設(shè)備中，使其歸于中性點，終點顏色為微微亮藍(lán)色，下次測試從加入I2-KI溶液開始。

式（2）中，k是比例系數(shù)，取值范圍為0.9～1.2，其中0.9表明Na2S2O3體積為正常量的90%，1.2表明Na2S2O3過量20%；T為滴定系數(shù)，計算方法為：取10.0 mL I2-KI溶液，使用Na2S2O3滴定至褪色，消耗的Na2S2O3體積與I2-KI溶液體積（10.0 mL）的比值即為滴定系數(shù)。

1.3.1 比色法準(zhǔn)確性和耐受性測試

準(zhǔn)確性：對比I2-KI溶液體積，分別使用比例系數(shù)k為1.025、1.050、1.100和1.200對應(yīng)體積的硫代硫酸鈉溶液進(jìn)行測試，并在同條件下使用電導(dǎo)率測試混合時間，以電導(dǎo)率法測試結(jié)果為基準(zhǔn)，查看比色法的準(zhǔn)確性。

耐受性：對比硫代硫酸鈉體積添加量VN，分別使用比例系數(shù)k為0.900、0.950、1.000、1.025、1.050、1.100和1.200的硫代硫酸鈉溶液進(jìn)行測試，查看比色法在加入不同的硫代硫酸鈉溶液體積的適用性。

1.3.2 比色法重復(fù)性和再現(xiàn)性測試

通過比色法測定各種混合容器的混合時間。

重復(fù)性：同一人員在同一設(shè)備，相同速度重復(fù)混合時間測試。

再現(xiàn)性：選取不同材質(zhì)（不銹鋼SS，聚丙烯PP）混合設(shè)備，不同混合體積（35 L、100 L、350 L、3 000 L），不同混合速度（80～300 r/min），并由不同測試人員進(jìn)行重復(fù)測試，確定混合時間，并計算變異系數(shù)來評價該方法的再現(xiàn)性。

1.3.3 混合設(shè)備性能確認(rèn)測試

對可能影響混合設(shè)備性能的關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行了研究和評估。此處使用“最差條件法”進(jìn)行混合設(shè)備性能確認(rèn)，即在最大混合體積Vmax和最小混合速度nmin條件下，使用比色法進(jìn)行35～3 000 L不銹鋼罐體和100～1 000 L聚丙烯罐體的混合時間測試。

在最大混合體積Vmax和最小混合速度nmin條件下，使用比色法進(jìn)行35～3 000 L不銹鋼（SS）罐體和100～1 000 L聚丙烯（PP）罐體的混合時間測試，用以獲取混合設(shè)備性能并指導(dǎo)試劑生產(chǎn)的混合工藝。

1.3.4 IVD實際生產(chǎn)應(yīng)用測試

根據(jù)文獻(xiàn)，密度差＜0.5 g/cm3時，預(yù)計不會影響混合時間[3]。血清和血漿的運(yùn)動粘度在2 mPa·s的范圍內(nèi)，因此與水的粘度1 mPa·s數(shù)量級相同。根據(jù)文獻(xiàn)對于粘度比水高兩個數(shù)量級以內(nèi)的物質(zhì)，如果在湍流狀態(tài)下進(jìn)行混合，則混合時間幾乎不受粘度影響[4]。

以一種密度為1.010～1.037 g/cm3的IVD免疫產(chǎn)品為例，進(jìn)行混合試驗。部分產(chǎn)品中應(yīng)用到血清粘度為2 mPa·s，符合該測試方法的應(yīng)用范圍。因此，在該產(chǎn)品的實際生產(chǎn)中，應(yīng)用“1.3.3”比色法測得的混合時間作為生產(chǎn)工藝各個均質(zhì)化步驟的混合時間進(jìn)行生產(chǎn)，并在溶液的上中下3層各10個點均勻分布取樣測試電導(dǎo)率，評價試劑的混合均勻性。對比工藝設(shè)計中的15～30 min的混合時間，評價比色法測試混合時間的適用性，達(dá)到指導(dǎo)混合工藝優(yōu)化的目的。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用Minitab 18.1統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行正態(tài)性檢驗，P＞0.05符合正態(tài)分布；3組數(shù)據(jù)進(jìn)行Bartlett等方差檢驗，P＞0.05方差齊性；3組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析的單因子方差分析，P＞0.05說明統(tǒng)計學(xué)上5 min、15 min、30 min混合質(zhì)量無顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 比色法準(zhǔn)確性和耐受性

如表1所示，相對I2-KI體積過量2.5%的硫代硫酸鈉是可行的，硫代硫酸鈉體積不足會導(dǎo)致溶液不褪色，體積過量會導(dǎo)致溶液褪色所得的混合時間與基準(zhǔn)方法誤差增大。如硫代硫酸鈉體積過量較多，過高的濃度導(dǎo)致硫代硫酸鈉快速在溶液體系中消耗掉大部分碘單質(zhì)導(dǎo)致褪色，而此時過量的硫代硫酸鈉尚未在攪拌作用下分散均勻，會導(dǎo)致測定的混合時間與基準(zhǔn)方法誤差增大。根據(jù)測試結(jié)果，選取k=1.025作為硫代硫酸鈉溶液加入體積比例系數(shù)，即VN=1.025×T×VI。此條件下，測試方法的結(jié)果同電導(dǎo)率法測試結(jié)果對比，誤差較小，為3.4%。

2.2 比色法重復(fù)性和再現(xiàn)性

混合時間的變化是由于溶液體積測量的不準(zhǔn)確、硫代硫酸鈉溶液的添加時間計時不準(zhǔn)確、是否肉眼觀察判斷、是否可見顏色條紋不準(zhǔn)確以及重復(fù)使用過程中中性點調(diào)節(jié)不準(zhǔn)確和不同人員的測試習(xí)慣所致。如表2所示，4個重復(fù)測量的變異系數(shù)（CV）在2.7%～9.4%。將方法精度的上限設(shè)為10%，即如果測試混合時間為100 s，則認(rèn)為110 s可以混合均勻，達(dá)到95%的混合質(zhì)量。

表1 準(zhǔn)確性和耐受性測試結(jié)果

表2 重復(fù)性和精密度測試結(jié)果

2.3 混合設(shè)備性能確認(rèn)

如表3所示，在最大混合體積Vmax和最小混合速度nmin條件下，35～3 000 L不銹鋼（SS）罐體和100～1 000 L聚丙烯（PP）罐體最長的混合時間不超過4 min。

2.4 IVD實際生產(chǎn)應(yīng)用

考慮到方法的準(zhǔn)確性和商業(yè)風(fēng)險，IVD實際生產(chǎn)中混合時間選取5 min。如表4所示，對5 min、15 min、30 min 3組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，P＞0.05，符合正態(tài)分布；3組數(shù)據(jù)進(jìn)行Bartlett等方差檢驗，P＞0.05，方差齊性；3組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析的單因子方差分析，P＞0.05，說明統(tǒng)計學(xué)上3組混合質(zhì)量無顯著差異。

表3 混合設(shè)備性能確認(rèn)

表4 不同均質(zhì)化混合時間電導(dǎo)率數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

對比原有參數(shù)，比色法獲取的混合時間從15～30 min縮短至5 min，混合質(zhì)量無顯著差異?？梢钥s短生產(chǎn)混合時間，給予工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)混合工藝的優(yōu)化指導(dǎo)。典型的免疫產(chǎn)品約需要10步左右的均質(zhì)化，包含加入鹽類、防腐劑、表面活性劑、抗原/抗體，pH調(diào)節(jié)以及子溶液混合等均質(zhì)化步驟，如單個均質(zhì)化步驟能從15 min縮短到5 min，單個溶液配制可以節(jié)約近2 h，原需要超過1個工作日完成的溶液配制工作有望在1個工作日內(nèi)完成。相應(yīng)的溶液配制人員和設(shè)備都可以解放出來進(jìn)行下一批次的生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效率，增加產(chǎn)能。

3 結(jié)論

該比色法以經(jīng)典顏色變化反應(yīng)（碘量）作為基礎(chǔ)，對不同規(guī)模的混合設(shè)備的混合時間進(jìn)行了試驗測試，建立了最大到3 000 L的工業(yè)規(guī)?；旌显O(shè)備的混合時間測定方法。該法適用于一定密度和粘度范圍內(nèi)的液體混合時間測定，測量結(jié)果相對準(zhǔn)確。該法可以對現(xiàn)有的混合容器進(jìn)行性能測試，用測得的混合時間指導(dǎo)和改進(jìn)混合工藝，縮短混合時間，達(dá)到提高生產(chǎn)效率的目的。