李玲梅，張娟娟

（洛陽(yáng)師范學(xué)院 食品與藥品學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471934）

目前,評(píng)價(jià)枸杞質(zhì)量的指標(biāo)通常是枸杞多糖（Lycium Barbarium Polysaccharides，LBP）、甜菜堿、總糖的含量，尤其以枸杞多糖為主[1]。研究證實(shí)，枸杞多糖在抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要作用[2]。所以對(duì)其提取分離及其相關(guān)研究成為很多科研工作者的研究方向，也是對(duì)枸杞進(jìn)行深加工和分子水平研究的基礎(chǔ)與前提。

常用的提取方法有水提醇沉法、酶提取法、超聲提取法、微波提取法、超臨界流體萃取法等[3]。陳靖等[4]采用冷浸法提取，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出最佳提取工藝為料液比1∶6（g∶mL），冷浸3次，每次8 h。韓秋菊等[5]采用熱水浸提法提取枸杞多糖，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出最佳工藝為料液比1∶20（g∶mL），溫度70 ℃，提取時(shí)間4 h，提取次數(shù)3次，提取率4.51%。熱水浸提法優(yōu)點(diǎn)是試劑易得、條件簡(jiǎn)單，適合游離多糖的提取；但需要多次提取，操作時(shí)間較長(zhǎng)。胡仲秋等[6]通過(guò)堿提取枸杞多糖的最佳工藝為料液比1∶70（g∶mL），pH為10，溫度為65 ℃，浸提時(shí)間3.5 h，該條件下枸杞多糖的收率最高，并顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的熱水浸提法。堿提取法的原理是堿性條件下破壞細(xì)胞壁，有利于酸性多糖的提取，優(yōu)點(diǎn)是能增加多糖含量，但提取成分復(fù)雜，還容易水解部分多糖，破壞多糖結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取率降低。李陽(yáng)等[7]采用酶法提取枸杞多糖的最佳工藝為料液比1∶45（g∶mL），pH為3.5，溫度為55 ℃，提取時(shí)間2 h，提取率高達(dá)7.40%。酶法提取植物多糖是利用酶和熱水浸提相結(jié)合的方法，具有反應(yīng)條件溫和、效率高、雜質(zhì)易除、工藝簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但是酶的價(jià)格較高，使用條件苛刻。史高峰等[8]采用微波輔助提取法研究枸杞多糖，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出當(dāng)以水為萃取溶劑，料液比1∶12（g∶mL），微波功率500 W，回流時(shí)間40 min時(shí)，枸杞多糖提取率高達(dá)13.56%。微波提取法能縮短提取時(shí)間、提高提取率、降低成本等，但由于能量巨大，會(huì)破壞有效成分。孟良玉等[9]采用超聲輔助提取技術(shù)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出當(dāng)提取溫度60 ℃、溶劑比1∶50（g∶mL）、超聲提取40 min、提取2次時(shí)，提取率最高可達(dá)14.48%。超聲提取法的優(yōu)點(diǎn)是可以大幅度提高有效成分的提取率，縮短提取時(shí)間，節(jié)省溶劑，污染小且有利于提取熱不穩(wěn)定物質(zhì)，能避免長(zhǎng)時(shí)間高溫對(duì)有效成分的破壞。

枸杞作為我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源資源之一，雖然歷史悠久，但是以枸杞為原料的高附加值產(chǎn)品較少，目前開(kāi)發(fā)利用多集中在粗放型加工的產(chǎn)品[10]。要對(duì)枸杞進(jìn)行深加工，需要研究其主要的生物活性物質(zhì)——枸杞多糖。通過(guò)比較不同提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)，探討在同溫同料液比條件下不同提取方法對(duì)枸杞多糖提取率及多糖含量的影響，為枸杞的深度開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞，產(chǎn)自中衛(wèi)市中寧縣舟塔鄉(xiāng)潘營(yíng)村。取枸杞原料于60 ℃烘箱中干燥至恒重，粉碎過(guò)60目篩，備用。

苯酚，分析純，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；葡萄糖對(duì)照品，分析純，上海阿拉丁試劑有限公司；乙醇、丙酮、石油醚、濃硫酸，分析純，天津化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器

FA2004電子天平，上海舜宇恒平科技儀器有限公司；UV-2600紫外分光光度儀，日本島津公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技儀器有限公司；TD5Z離心機(jī)，華瑞科器有限公司；D2F-6020A真空干燥箱，恒諾利興有限公司；LC-N-1100D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，力辰科技有限公司；FD-1B冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；KH-100E超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；WF-400微波快速反應(yīng)系統(tǒng)，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 枸杞多糖的提取

1.3.1 熱水浸提法

準(zhǔn)確稱取粉碎過(guò)的枸杞原料10.0 g于燒杯中，第1次按料液比1∶20（g∶mL）加入蒸餾水200 mL于90 ℃水浴中提取2 h，4 000 r/min離心10 min得到殘?jiān)吞崛∫?；?次按料液比1∶10（g∶mL）加入蒸餾水100 mL于90 ℃水浴中提取1 h，4 000 r/min離心10 min，取上清液，兩次提取液合并，60 ℃減壓濃縮至總體積的1/4；加入4倍量的95%乙醇，在4 ℃下沉淀12 h，抽濾，依次用無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚洗滌沉淀，冷凍干燥后得到粗枸杞多糖，稱重。重復(fù)操作3次。

1.3.2 堿提取法

提取方法同“1.3.1”，在每次水浴前添加“用氨水調(diào)節(jié)溶液pH為10”步驟。

1.3.3 超聲提取法

提取方法同“1.3.1”，僅將“90 ℃水浴中提取2 h”改為“在超聲頻率為45 kHz、90 ℃下提取40 min”。

1.3.4 微波提取法

提取方法同“1.3.1”，僅將“90 ℃水浴中提取2 h”改為“在微波功率為300 W、90 ℃下提取20 min”。

1.4 枸杞多糖的純化

Saveg法除蛋白[11]：取枸杞多糖粗品加適量蒸餾水溶解，3 000 r/min離心10 min后取上清液，加30%雙氧水適量，40 ℃保溫4 h后，加三氯甲烷-正丁醇（4∶1）溶液沉淀蛋白，劇烈振搖后，棄去中層變性蛋白和下層氯仿層，取上清液；此步驟重復(fù)多次，直至無(wú)白色絮狀沉淀為止。然后濃縮提取液，水浴揮干溶劑，得到較純的枸杞多糖，冷凍干燥，備用。

1.5 枸杞多糖提取率的測(cè)定

根據(jù)公式（1）計(jì)算枸杞多糖提取率。

1.6 枸杞多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定枸杞多糖含量[12]。

1.6.1 制備標(biāo)準(zhǔn)溶液

將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在105 ℃干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容；準(zhǔn)確量取10 mL于另一100 mL容量瓶中，定容，得到0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.6.2 配制5%苯酚溶液

苯酚于60 ℃水浴加熱溶解后稱取150 g，加入0.1 g鋁片和0.05 g NaHCO3，進(jìn)行常壓蒸餾，收集182 ℃的餾分，取餾分40 g加入10 mL蒸餾水置于50 mL棕色瓶?jī)?nèi)，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL于試管中，加蒸餾水補(bǔ)足至2 mL；各試管加入1 mL 5%苯酚溶液搖勻，緩慢加入5 mL濃硫酸搖勻后于60 ℃恒溫水浴30 min，取出迅速冷卻至室溫；以蒸餾水為空白，在485 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。

1.6.4 樣品含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取枸杞多糖樣品100 mg于100 mL容量瓶?jī)?nèi)，定容，精密量取10 mL于另一100 mL容量瓶，定容，搖勻，備用。

分別精密量取各枸杞多糖1.0 mL于具塞試管中，加入1 mL 5%的苯酚溶液搖勻，緩慢加入5 mL濃硫酸搖勻后于60 ℃恒溫水浴30 min，取出迅速冷卻至室溫，在485 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3次。根據(jù)公式（2）計(jì)算枸杞多糖含量。

式（2）中，c為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的濃度；D為樣品稀釋倍數(shù)；f=3.19為換算因子；m為樣品質(zhì)量；v為量取的體積1 mL。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，計(jì)算出平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS 16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度x為橫坐標(biāo)，吸光度值y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到線性方程y=8.508 9x+0.020 7，R2=0.997 9。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在0.02～0.12 mg/mL與吸光度值之間線性關(guān)系良好。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 枸杞多糖含量測(cè)定

枸杞多糖提取率和多糖含量如表2所示。不同方法的枸杞多糖提取率差異明顯，微波提取法＞超聲提取法＞堿提取法＞熱水浸提法；將其他3種方法與熱水浸提法進(jìn)行比較，差異性明顯，其中微波提取法枸杞多糖提取率比熱水浸提法枸杞多糖提取率高6.05%；超聲提取法與微波提取法的多糖含量基本相同，超聲提取法最高，原因可能為枸杞粗多糖中含有水溶性色素或其他雜質(zhì)成分影響含量測(cè)定結(jié)果。

表2 不同提取方法結(jié)果比較

3 結(jié)論

在浸提次數(shù)、料液比和提取溫度相同條件下，對(duì)比不同提取方法對(duì)枸杞多糖提取率及多糖含量的影響，得出微波提取法和超聲提取法在枸杞多糖提取率和多糖含量上均高于熱水浸提法，其中微波提取法的枸杞多糖提取率高達(dá)11.40%，多糖含量達(dá)86.13%，這為枸杞的深加工和枸杞多糖的進(jìn)一步分離純化等研究奠定了基礎(chǔ)。