莊霄玲，崔以晴，張雪蓮

（1.上海復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433；2.上海藥明生物技術(shù)有限公司，上海 200131）

隨著單克隆抗體藥物的應(yīng)用日益廣泛，臨床上對(duì)注射體積小、濃度高的抗體制劑需要越來越迫切。該類制劑濃度非常高（通常大于150 mg/mL），無論是樣品的制備還是保持樣品的穩(wěn)定性都具有很大的挑戰(zhàn)[1]。本文利用正交試驗(yàn)對(duì)系統(tǒng)運(yùn)行的操作參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)，找到了較優(yōu)的操作條件，并對(duì)工藝參數(shù)的選擇進(jìn)行了分析探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中用于超濾滲濾開發(fā)的樣品均為經(jīng)過陽離子洗脫的樣品，純度大于99%；醋酸、醋酸鈉、氯化鈉，購于臺(tái)山市新寧制藥有限公司；組氨酸、組氨酸鹽酸鹽，購于上海協(xié)和氨基酸有限公司；海藻糖，購于日本株式會(huì)社林原。所有試劑均符合藥用級(jí)別。

Pellicon D 30 kD超濾膜包，Millipore公司；Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)，Thermo Scientific公司；Seven Excellence pH電導(dǎo)率計(jì)一體機(jī)，Mettler Toledo公司；XPE10002S電子天平，Mettler Toledo公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超濾整體工藝

起始樣品進(jìn)樣流速和跨膜壓力（TMP）優(yōu)化→濃縮→換液緩沖液確定→換液時(shí)間點(diǎn)確定→換液→再濃縮→產(chǎn)品回收

室溫下，在超濾膜夾具上完成所有超濾實(shí)驗(yàn)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中的中間產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)分析，如用NANODROP2000測(cè)蛋白的濃度，用HPLC分子排阻法檢測(cè)單體純度等。

1.2.2 超濾單因素試驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)中，固定載量為400 g/m2，樣品濃度為15 g/L，超濾膜面積為88 cm2，并處于醋酸緩沖體系中。以超濾膜透過通量作為試驗(yàn)指標(biāo)，研究蛋白超濾在不同進(jìn)口流速（11.7 mL/min、23.5 mL/min、35.2 mL/min、46.9 mL/min和 58.7 mL/min），不同的操作溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃），不同跨膜壓力（69 kPa、103 kPa、138 kPa、172 kPa、209 kPa）對(duì)蛋白透過的影響，然后進(jìn)一步優(yōu)化。

1.2.3 超濾實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在“1.2.2”的基礎(chǔ)上，考慮到產(chǎn)品質(zhì)量和過濾效率，固定進(jìn)口流速為46.9 mL/min，操作溫度為28 ℃，然后以緩沖液類型A、樣品濃度B和超濾跨膜壓力C為自變量，該蛋白的膜透過通量[L/（m2·h）]單體純度（%）為試驗(yàn)指標(biāo)，對(duì)超濾濃縮換液工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。如表1所示，正交設(shè)計(jì)采用3因素3水平[2]。

表1 超濾實(shí)驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 操作溫度對(duì)膜通量的影響

如圖1所示，膜的滲透通量隨著料液溫度的升高先增大后逐漸降低。在20～30 ℃，隨著溫度的增加和蛋白質(zhì)黏性降低，擴(kuò)散系數(shù)和傳質(zhì)系數(shù)增加，所以該溫度范圍內(nèi)超濾膜膜通量增加明顯。而當(dāng)溫度大于30 ℃，超濾膜的透過通量增加速率變緩甚至降低，這可能是因?yàn)椋海?）當(dāng)溫度超過一定限度后，蛋白有發(fā)生聚集的傾向；（2）隨著溫度升高，膜表面?zhèn)髻|(zhì)效率增加，膜的凝膠層加厚而導(dǎo)致膜孔逐漸堵塞[3]。統(tǒng)計(jì)分析表明，料液溫度20 ℃、25 ℃、30 ℃之間膜通量差異明顯，且結(jié)合蛋白質(zhì)本身性質(zhì)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)液溫度控制為25～30 ℃。

圖1 操作溫度與膜通量的關(guān)系

2.2 進(jìn)樣流速對(duì)膜通量的影響

如圖2所示，當(dāng)進(jìn)口流速從11.7 mL/min增加到58.7 mL/min，膜通量也隨之增加，所以進(jìn)樣流速定為58.7 mL/min。

圖2 進(jìn)口流速與膜通量的關(guān)系

2.3 跨膜壓力對(duì)膜通量的影響

如圖3所示，當(dāng)壓力從69 kPa增到138 kPa，膜通量增加顯著，此時(shí)符合非平衡熱力學(xué)模型的Spiegler-Kedem 方程 Jv=Lp(ΔP-σΔπ)和溶解 -擴(kuò)散模型，在溶液濃度一定時(shí)，膜通量與操作壓力呈正相關(guān)線性關(guān)系，因此壓力增大會(huì)導(dǎo)致通量增大。當(dāng)跨膜壓力大于138 kPa時(shí)，膜通量的增加趨勢(shì)逐漸平緩并達(dá)到拐點(diǎn)值。這可能是由于跨膜壓力過大，會(huì)加速有些物質(zhì)在膜孔的堆積，超濾膜會(huì)逐漸被濃差極化，導(dǎo)致傳質(zhì)阻力增加，此時(shí)溶質(zhì)濃度達(dá)到了其可溶解的極限，可能會(huì)因此導(dǎo)致產(chǎn)品跨膜壓力與膜通量的關(guān)系收率的下降。此外，濃差極化的后期可能導(dǎo)致膜堵塞，會(huì)引起膜通量下降且不可逆轉(zhuǎn)[3]。統(tǒng)計(jì)分析表明，跨膜壓力69 kPa、103 kPa、138 kPa之間膜通量差異明顯（P＜0.05），且結(jié)合蛋白質(zhì)本身性質(zhì)，選取跨膜壓力138 kPa為最優(yōu)條件。

圖3 跨膜壓力與膜通量的關(guān)系

2.4 超濾滲濾正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。從生產(chǎn)效率和樣品本身穩(wěn)定性來看，在此蛋白超濾濃縮換液過程中，應(yīng)當(dāng)使蛋白在盡可能低的濃度下進(jìn)行換液，換液緩沖液為組氨酸體系，跨膜壓力定為138 kPa，即最優(yōu)方案為A3B1C2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

實(shí)際超濾濃縮換液生產(chǎn)過程中由于設(shè)備和放大操作條件的限制，最佳操作條件可以根據(jù)實(shí)際情況的變化而稍微作出改變。（1）蛋白濃度對(duì)膜通量的影響最具顯著性。在實(shí)際超濾換液中，低濃度下通量較高，但換液體積大，需要較大超濾膜面積和較多緩沖液體積；而濃度太高時(shí)雖然換液緩沖液體積較少，但換液流速太低同樣會(huì)增加超濾膜面積成本。因此后續(xù)經(jīng)過探索，此蛋白濃縮至70～90 mg/mL時(shí)進(jìn)行換液至組氨酸溶液中。（2）在組氨酸和醋酸緩沖體系中，進(jìn)口流速為44 mL/min，樣品濃度為90 g/L，考察跨膜壓力在69～209 kPa下膜的透過通量變化。發(fā)現(xiàn)在組氨酸體系中，需要更大的TMP才能達(dá)到壓力不相關(guān)區(qū)，推測(cè)原因可能是因?yàn)榫彌_液中存在的一些物質(zhì)會(huì)與目標(biāo)蛋白發(fā)生作用，使其形態(tài)發(fā)生變化，改變了其在膜包表面達(dá)到平衡的條件，所以建議在換液到組氨酸緩沖液后，跨膜操作壓力為172 kPa。（3）在實(shí)際生產(chǎn)中，雖然較大的切向流量對(duì)超濾膜表面有一定的“清洗”作用，從而緩解濃差極化現(xiàn)象。但是隨著樣品濃度越來越高，粘度越來越大，過高的進(jìn)口切向流速也可能導(dǎo)致蛋白的活性降低且需要配置更大的泵和更大直徑的管道，循環(huán)泵損耗大，所以最后確定換液后進(jìn)樣泵速為250 L/(m2·h)。

3 結(jié)論

高濃度抗體超濾工藝的最佳工藝參數(shù)：進(jìn)口流速37.0～46.9 mL/min，跨膜壓力在 132～172 kPa，濃縮至濃度70～90 g/L時(shí)換液至組氨酸緩沖液，再濃縮至制劑濃度后加入相關(guān)輔料母液。在該超濾滲濾工藝中，樣品濃度和緩沖液類型對(duì)超濾影響較大。