馮雪，徐志強，張雪楠，趙琳，裴友財，楊紅育

（長春生物制品研究所有限責任公司，吉林長春 130012）

流感病毒裂解疫苗主要用于預防由流感病毒引起的流行性感冒。在生產過程中，一般加入適宜濃度的甲醛溶液進行病毒滅活。因此，游離甲醛是疫苗檢測的一個重要指標。目前，測定游離甲醛的主要方法有電化學法、分光光度法、液相色譜法、氣相色譜法等[1-7]。本文根據CNAS-GL006:2019《化學分析中不確定度的評估指南》[8]和JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[9]規(guī)定的方法，對頂空-氣相色譜法測定流感病毒裂解疫苗中游離甲醛殘留量不確定度進行分析，為提高測量結果的準確性和精確度提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

流感病毒裂解疫苗，長春生物制品研究所有限責任公司；100 μg/mL水中甲醛溶液標準物質，北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司。

1.2 儀器設備

7890A型氣相色譜儀，配FID檢測器，7697A頂空自動進樣器，色譜柱DB-1301（30 m × 0.320 mm，0.25 μm），Agilent TechnoLogies公司。

1.3 實驗條件

1.3.1 頂空條件

頂空平衡溫度100 ℃，平衡時間30 min；定量環(huán)溫度110 ℃，傳輸線溫度120 ℃。

1.3.2 色譜條件

進樣口溫度200 ℃，檢測器溫度250 ℃，柱溫60 ℃；保持時間10 min，恒定流量1.0 mL/min，分流比為20∶1；空氣流量400 mL/min，氫氣流量35 mL/min，尾吹流量25 mL/min；載氣為高純氮氣，純度不小于99.999%。

1.4 測定方法

1.4.1 標準溶液的制備及測定

量取100 μg/mL水中甲醛溶液標準物質，用超純水稀釋，配制成濃度為0.001 μg/mL、0.005 μg/mL、0.010 μg/mL、0.020 μg/mL、0.040 μg/mL 的標準系列溶液。取標準系列溶液1.0 mL分別置于頂空瓶中，頂空蓋密封。按實驗條件進行測定。

1.4.2 樣品測定

量取樣品1.0 mL置于頂空瓶中，頂空蓋密封。按實驗條件進行測定。

1.5 數學模型

1.5.1 計算公式

樣品中游離甲醛殘留量的計算公式如式（1）所示：

式（1）中，C為待測樣品中游離甲醛的質量濃度，μg/mL；Ci為從標準曲線上計算出的游離甲醛的質量濃度，μg/mL。

1.5.2 不確定度來源分析

從測定過程分析，測量不確定度主要來自以下4個方面：（1）重復測量樣品引入的不確定度；（2）標準物質引入的不確定度；（3）標準系列溶液配制過程引入的不確定度；（4）標準曲線擬合引入的不確定度。依據JJF1059.1-2012規(guī)范，分析不確定度性質可知，重復性測量引入的不確定度采用A類不確定度評定，其余分量采用B類不確定度評定[10-11]。

2 結果與分析

2.1 不確定度評定urel(A)

2.1.1 A類不確定度評定

A類不確定度主要由樣品重復測定引入，為獲得樣品重復測定的不確定度分量，對兩批流感病毒裂解疫苗及不同濃度的樣品溶液分別進行3次重復測量，根據公式（2）和（3）計算相對標準不確定度，結果見表1。

2.1.2 B類不確定度評定urel(B)

2.1.2.1 標準物質引入的不確定度

根據標準物質證書，相對擴展不確定度為5%，k=2，因此標準物質引入的相對標準不確定度為

2.1.2.2 標準系列溶液配制過程引入的不確定度

標準系列溶液配制過程使用了0.1 mL、0.5 mL、5.0 mL分度吸量管，100 mL容量瓶，1 mL單標線吸量管。根據校準證書，玻璃量具引入的不確定度見表2。

表1 樣品重復測定及相對標準不確定度結果

在標準系列溶液配制過程中，使用0.1 mL分度吸量管1次，0.5 mL分度吸量管1次，5 mL分度吸量管1次，1 mL單標線吸量管2次，2 mL單標線吸量管1次，100 mL容量瓶6次，由表2數據合成的相對標準不確定度如公式（4）所示。

表2 標準溶液配制中玻璃器具引入的不確定度

2.1.2.3 標準曲線擬合引入的不確定度

實驗中對每一濃度的標準溶液分別測定3次，得到相應的峰面積。用最小二乘法對濃度和峰面積進行擬合，得到直線方程y=ax+b及其相關系數，結果詳見表3。

表3 標準系列溶液濃度與對應的峰面積

根據公式（5）～（7）計算出測定不同濃度樣品時，由標準曲線擬合引入的不確定度，計算結果見表4。

式（5）～（7）中，Ai為標準溶液各濃度測定所對應的峰面積；Ci為標準溶液的濃度，μg/mL；s為標準溶液待測物質殘差的標準差，s=0.128；a為標準曲線的斜率，a=561.893 46；p為同一樣品測定的次數；n為標準溶液測定的總次數，共測定了5種不同濃度的溶液，每種濃度測定3次，n=5×3=15；x—為測定樣品中游離甲醛的平均濃度，μg/mL；c—為標準溶液的平均濃度，

表4 標準曲線擬合引入的不確定度

2.1.3 相對合成標準不確定度urel(c)

綜合上述各不確定度分量，根據公式（8）計算相對合成標準不確定度，結果見表5。

2.1.4 擴展不確定度與結果表示

按照一般慣例，取包含因子k=2，則相對擴展不確定度為Urel=urel（c）×2。流感病毒裂解疫苗（批號20180712）的測量結果為0.001 672 62 μg/mL，Urel=31.54%；流感病毒裂解疫苗（批號20180718）的測量結果為 0.003 479 49 μg/mL，Urel=18.44%；0.006 μg/mL的樣品溶液測量結果為0.006 318 27 μg/mL，Urel=11.00%；0.01 μg/mL的樣品溶液的測量結果為0.009 893 79 μg/mL，Urel=7.50%；0.02 μg/mL 的樣品溶液的測量結果為0.019 328 73 μg/mL，Urel=5.96%。

表5 樣品的不確定度分量

3 結論

本研究從測量過程著手，識別和量化了各個來源的不確定度，并討論了待測物濃度不同時，各分量對總不確定度的影響。結果表明，當待測濃度較低時，標準曲線擬合對測定結果影響最大，重復測量及標準物質影響次之；隨著待測物濃度的提高，標準曲線擬合對測定結果的影響逐漸減小。因此，可以增加標準系列溶液試驗點數，選用不確定度較小的標準溶液，進行多次重復測量，從而降低測量不確定度，提高測量的精密度及準確度。