龍繼艷，戴明，鐘瑤，李夢鑫，蔣詠梅

（福建師范大學 生命科學學院，福建福州 350007）

納豆風味獨特，是以大豆為原料經(jīng)蒸煮后接入枯草芽孢桿菌發(fā)酵而成的傳統(tǒng)食品，至今已有上千年的歷史。1987年，Sumi等人[1]首次從納豆中提取到納豆激酶，并對其進行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)其屬于絲氨酸蛋白酶，具有顯著的溶栓活性，可切開血栓上的纖維蛋白凝塊。除此之外，納豆激酶還可以誘導纖溶酶原激活劑的產(chǎn)生，從而激活自身的纖溶系統(tǒng)[2]。納豆激酶安全無毒，在人體內(nèi)溫度和pH條件下，性能穩(wěn)定，半衰期長，能夠溫和持續(xù)地預防血栓的形成。除含有納豆激酶外，納豆中的糖肽活性物質、胰蛋白酶抑制劑、異黃酮和多胺等抗癌物質的含量也遠高于原料大豆，食用納豆及相關產(chǎn)品不僅可以防治心血管疾病，還有助于人體健康。

20世紀90年代以來，納豆的發(fā)酵工藝已成為研究熱點，除對傳統(tǒng)的大豆固體發(fā)酵納豆工藝進行優(yōu)化之外，人們嘗試了豆粕、豆渣等多種原料[3]，并通過液體發(fā)酵方式提高納豆激酶的產(chǎn)量[4]，均取得一定進展。盡管納豆的保健功能已為眾人熟知，但納豆相關產(chǎn)品在我國市場占有率很低，其原因是在納豆發(fā)酵過程中，大豆蛋白質降解為氨基酸時產(chǎn)生一種特殊的氨臭味。因此，降低納豆中氨臭味成為其市場化的關鍵所在。本實驗選擇黃豆、綠豆和紅豆作為原料發(fā)酵納豆，綜合感官評價、酶活測定和體外溶栓實驗結果，選擇最適原料進行納豆產(chǎn)品的研制，以期為納豆食品的開發(fā)提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 原料

納豆芽孢桿菌，本實驗室分離保藏。

1.1.2 儀器與試劑

HWS-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱，寧波新藝超聲儀器設備有限公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；GI54DWS高壓蒸汽滅菌鍋，廈門精藝興業(yè)科技有限公司；TG16-WSD臺式高速離心機，湖南湘儀儀器有限公司；SW-CJ-2D凈化工作臺，蘇州智凈凈化設備有限公司。

牛纖維蛋白原、牛凝血酶，上海源葉生物科技有限公司；尿激酶，中國食品藥品檢定研究院。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化及種子液制備

斜面保藏菌株接入30 mL液體種子培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.2 納豆發(fā)酵工藝

分別選取黃豆、綠豆和紅豆，清洗浸泡16 h使之充分吸水膨脹，瀝水后于121 ℃滅菌20 min，冷卻至50 ℃左右，2 %接種量接入種子液，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，置4 ℃冰箱后熟。

1.2.3 酶液制備

取適量納豆樣品于燒杯中，加入5倍體積NaCl溶液（0.9%），攪拌2 h，4 ℃下10 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

1.2.4 納豆激酶活性測定

采用纖維蛋白平板法[5]。以不同濃度尿激酶標準品（100 U/mL、200 U/mL、300 U/mL、400 U/mL、500 U/mL）各10 μL點樣于纖維蛋白平板，以溶解圈面積為橫坐標，酶活力為縱坐標作圖，繪制標準曲線。以待測粗酶液代替尿激酶標準品，其余條件同上，測量溶解圈的直徑，根據(jù)標準曲線計算納豆激酶活力。

1.2.5 納豆激酶體外溶栓實驗

稀釋待測酶液至10倍、50倍、200倍和1 000倍，取原液和各個稀釋液6 mL置于50 mL潔凈干燥離心管中，以pH為7.2的磷酸緩沖液為空白對照。取自然凝固新鮮雞血，分割為1.5 g左右小血塊，分別稱重（W1）后加入上述離心管，37 ℃恒溫水浴，分別于0 h、4 h、8 h、12 h和16 h取出血塊后稱重（W2），根據(jù)公式（1）計算溶解率。

1.2.6 納豆糕的研制

納豆碾碎，加入一半重量的炒熟面粉及適量白砂糖，揉捏混合均勻，裝入模具，制成成品。

從氣味、口感、色澤、外型、內(nèi)部組織5個最為直觀的角度，設計納豆糕感官評定標準如表1所示。

2 結果與分析

2.1 不同原料對納豆發(fā)酵的影響

黃豆、綠豆和紅豆分別經(jīng)清洗浸泡、高壓蒸煮后，進行納豆發(fā)酵。感官特征如表2所示，黃豆納豆的豆粒完整、口感綿軟；紅豆納豆的豆粒完整度低、硬度較大，口感較差；綠豆納豆雖完整性較弱，但口感綿軟。不同種類豆粒的內(nèi)部結構存在差異，因此需要的浸泡時間和蒸煮條件也不相同[6]。根據(jù)納豆的菌膜厚度和拉絲長度可初步判斷發(fā)酵過程中納豆菌的生長情況。由表2可見，黃豆納豆的菌膜最厚，粘液多，拉絲長約28 cm，說明納豆菌生長良好。相比黃豆，綠豆表面的菌膜較薄，拉絲較短，約15 cm。3種納豆中，紅豆的發(fā)酵度最低。黃豆納豆雖發(fā)酵完全、口感綿軟，但氨味也十分明顯，比較而言，綠豆和紅豆的氨味均較低，屬于可以接受的范圍。

表1 納豆糕感官評定標準

表2 納豆感官特征

2.2 納豆激酶活力測定結果

如圖1所示，溶解圈面積與納豆激酶活性呈線性正相關，標準曲線方程為Y=4.692 64X-463.707 4，R2=0.996 09。

圖1 尿激酶纖溶性擬合曲線

利用纖維蛋白平板法檢測3種納豆的激酶活性。根據(jù)平板上透明圈半徑，通過圖1的標準曲線計算納豆激酶的活性，結果如圖2所示。3種納豆中，黃豆納豆酶活最高，達5 131.65 U/g，綠豆納豆的酶活2 338.02 U/g，紅豆僅139.38 U/g。與目前市售納豆[7]相比，本實驗中黃豆納豆的激酶活性較高，綠豆納豆的酶活性適中，紅豆納豆則明顯低于市售納豆。

2.3 納豆激酶體外溶栓結果

圖2 3種納豆激酶活性

如圖3所示，3種納豆激酶中，溶栓效果最好的是黃豆；3種納豆在18 h內(nèi)對血凝塊的溶解效率分別為55.8%、37.0%和24.4%，黃豆和綠豆納豆激酶溶栓速率較快，8 h內(nèi)即可完成，紅豆納豆激酶不僅溶栓效果弱，速度也相對較慢。該結果與3種納豆的激酶活性相對應：隨著酶液稀釋倍數(shù)的增加，血塊的溶解效率顯著減弱，可見不同劑量的納豆激酶對血凝塊的溶解率有明顯影響。

2.4 納豆糕的研制

由上述結果可見，黃豆納豆的酶活最高，體外溶栓效果最好，但卻有濃重的令人難以接受的氨味。而紅豆納豆的酶活力和體外溶栓效果均較低，保健價值不高。相比較而言，綠豆納豆不僅有較高的納豆激酶活性和良好的體外溶栓效果，且氨味較淡，具有良好的開發(fā)前景。因此，以綠豆納豆為原料進行了綠豆糕的研制，并隨機挑選15位感官評測員，根據(jù)表1進行品鑒打分，成品和評分結果見圖4。

圖3 納豆激酶對血凝塊的溶解效果

圖4 納豆糕成品及評價

由圖4A可見，綠豆納豆糕外型美觀、紋路清晰、顏色偏黃、外形完整。由圖4B可見，納豆糕的總體食用性還有待提高。單項指標中，氣味與色澤得分最低，均為8.3分。可見綠豆納豆雖優(yōu)于黃豆納豆，但其氨味仍不容忽視，后期可從改進納豆發(fā)酵工藝或調(diào)整納豆糕配比兩方面入手進行優(yōu)化。口感、外形、內(nèi)部組織得分較高。口感指標中，大多數(shù)評測員選擇“略粘牙”，說明納豆糕的咀嚼感需要改進，可通過添加少許油脂改善口感，若添加過多，反而會引發(fā)“三高”癥狀，與納豆糕的保健功能背道而馳。外形評分和內(nèi)部組織評分較高，部分評測員打分較低的原因是吃到細小的白砂糖顆粒，后續(xù)可采用綿白糖替代白砂糖。

本實驗納豆糕是由綠豆納豆、熟面粉和白砂糖3種成分組成，未添加油脂和其他成分，因此在感官評測方面有少許欠缺，后續(xù)可針對性增添其他成分，以達到更優(yōu)的口感和保健效果。

3 結論

選擇黃豆、綠豆和紅豆進行納豆發(fā)酵，對3種納豆激酶的活性和溶栓效果進行檢測，發(fā)現(xiàn)黃豆為原料發(fā)酵納豆的酶活最高，達5 319.30 U/g，體外溶栓效果最好。選擇氨味較弱、納豆激酶活性較高及溶栓效果較好的綠豆納豆進行納豆糕的研制，并對成品進行了感官評測，該結果可對納豆相關食品的開發(fā)提供參考。