柴振宇，苑麗園，周曉梅，田木，江飛鴻，趙旭瑞

（1.吉林師范大學(xué) 博達(dá)學(xué)院，吉林 四平136000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱150030；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春130118）

0 引言

近年來，人們研究發(fā)現(xiàn)了微生態(tài)制劑高效、無藥物殘留、不產(chǎn)生耐藥性的特點，并廣泛應(yīng)用于飼料加工、疾病治療與畜牧養(yǎng)殖業(yè)中。

微生態(tài)制劑具有激活機(jī)體免疫反應(yīng)，恢復(fù)微生態(tài)平衡，從而達(dá)到治療疾病的目的[1]。其主要包括乳酸菌制劑，酵母菌制劑以及枯草芽孢桿菌制劑等，但每種制劑的功效比較單一。

益生元（Prebiotics）不能直接對機(jī)體起作用，而是通過益生菌發(fā)揮生理功能[2]?！耙嫔?益生菌”被稱為合生元，其產(chǎn)品機(jī)理為：益生元向益生菌提供營養(yǎng)，腸道內(nèi)的有益菌能夠?qū)⑵浞纸狻⑾?、吸收，并促進(jìn)有益菌的生長繁殖[3]。益生元能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[4]，具有降血壓、降血糖[5]，延緩衰老[6]等生理功能。姬松茸多糖是常見的益生元，能抑制腫瘤細(xì)胞的生長，對致癌物質(zhì)有吸收、排泄的作用，對機(jī)體還能起到抗氧化、抗輻射、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和降血糖[8]的作用。

考慮已有研究[7]，選取德氏乳桿菌保加利亞種（Lactobacillus bulgaricussubsp.bulgaricus）和 嗜 熱 鏈 球 菌（Streptococcus thermophiles）的混合菌株作為發(fā)酵乳發(fā)酵劑，并以此為對照組的發(fā)酵劑；試驗組將姬松茸多糖和對照組的復(fù)合菌株經(jīng)低溫噴霧干燥技術(shù)制備的復(fù)合微生態(tài)制劑作為發(fā)酵乳發(fā)酵劑。通過兩組相關(guān)理化性質(zhì)和微生物指標(biāo)相對比，觀察兩種發(fā)酵劑對發(fā)酵乳發(fā)酵特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料乳，購于當(dāng)?shù)啬剔r(nóng)，脂肪為3.60%，蛋白質(zhì)為3.10%，抗生素檢測陰性；姬松茸多糖，杭州雪域生物技術(shù)有限公司提供；發(fā)酵乳發(fā)酵劑，實驗室制備，德氏乳桿菌保加利亞種(Lactobacillus bulgaricussubsp.bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus Thermophilus)的復(fù)合菌種。

PHS-3Cp H計，上海精科有限公司；PH-070A培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器公司；DV-Ⅲ黏度計，美國BROOKFIELD公司；電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；高速離心機(jī)，上海佑科儀器儀表有限公司；磁力攪拌器，金壇市大地自動化儀器廠；無菌超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 實驗試劑

氫氧化鈉、酚酞、硫酸、無水乙醇、甲基紅、溴甲酚綠購自四平市騰飛化學(xué)試劑商店；鄰苯二甲酸氫鉀，混合磷酸鹽，硼砂購自天津北辰方正試劑廠；硫酸銅，異戊醇購自天津大茂化學(xué)試劑廠；氯化鈉、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、MRS(Man Rogosa Sharpe)培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；氯化鈉胰酪胨大豆肉湯、血瓊脂平板、7.5%氯化鈉肉湯、Baind-Parker瓊脂平板、腦心浸出液肉湯（BHI）、兔血漿、磷酸鹽緩沖液、緩沖蛋白胨（BPW）、四硫酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硫酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、生化鑒定試劑盒購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 發(fā)酵乳的制備

發(fā)酵乳制備流程如下。

1.3.1 原料混合

準(zhǔn)確稱取7%的白砂糖加入到檢驗合格的原料乳中，充分混合后，經(jīng)200目的過濾網(wǎng)進(jìn)行過濾。

1.3.2 原料預(yù)熱

原料乳與白砂糖的混合物預(yù)熱到50～65℃，在此溫度下，乳脂肪成熔融狀態(tài)，脂肪球膜軟化，有利于提高均質(zhì)效果。

1.3.3 均質(zhì)

均質(zhì)可以使原料充分混勻，防止奶油上浮，保證乳脂肪均勻分布，有利于提高酸奶的穩(wěn)定性，使酸奶質(zhì)地細(xì)膩，口感更好，壓力采用20～25 MPa，溫度50～65℃。

1.3.4 熱處理

熱處理的主要目的是殺滅原料乳中的雜菌，確保益生菌的正常生長和繁殖。熱處理使原料乳中的乳清蛋白變性，達(dá)到改善組織狀態(tài)，提高黏稠度和防止成品乳清析出的目的。本實驗原料乳采用的熱處理參數(shù)為85℃，15 min。

1.3.5 冷卻

熱處理后的乳迅速降溫到發(fā)酵劑菌種的最適生長溫度，根據(jù)本實驗室發(fā)酵劑的特性，把熱處理后的乳迅速降溫到43±1℃。

1.3.6 接種

事先將發(fā)酵劑在無菌操作條件下攪拌成均勻細(xì)膩的狀態(tài)，不應(yīng)存在大的凝塊，以免影響成品質(zhì)量。在冷卻到43±1℃的乳中接種0.03%的發(fā)酵劑，試驗組的發(fā)酵劑為姬松茸多糖與德氏乳桿菌保加利亞種(Lactobacillus bulgaricussubsp.bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus Thermophilus)制備的合生元復(fù)合微生態(tài)制劑，對照組為德氏乳桿菌保加利亞種(Lactobacillus bulgaricussubsp.bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus Thermophilus)的復(fù)合菌種。

接種時要嚴(yán)格注意操作衛(wèi)生，防止細(xì)菌、霉菌、酵母菌、噬菌體以及其他有害微生物的污染。發(fā)酵劑加入后要充分?jǐn)嚢?，使發(fā)酵劑與原料乳混合均勻。

1.3.7 發(fā)酵

發(fā)酵乳制品在43℃發(fā)酵4～5 h。在此過程中要準(zhǔn)確控制溫度，保證溫度恒定，避免忽高忽低；避免震動帶來的組織狀態(tài)不良，掌握好發(fā)酵時間，防止酸度不夠或過度以及乳清析出。

1.3.8 冷藏后熟

待發(fā)酵乳制品達(dá)到凝固狀態(tài)即可終止發(fā)酵，一般發(fā)酵終點可以根據(jù)pH值達(dá)到4.6或者滴定酸度達(dá)到70 °T來判斷。

發(fā)酵好的凝固酸奶立即移入到4℃冰柜中，迅速抑制乳酸菌的生長，以免繼續(xù)發(fā)酵造成酸度升高。在冷藏后熟期酸度仍會上升，同時風(fēng)味成分雙乙酰含量增加，風(fēng)味物質(zhì)繼續(xù)產(chǎn)生，多種風(fēng)味物質(zhì)相互平衡形成酸乳的特征風(fēng)味。

1.4 產(chǎn)品的感官

酸奶完全凝固，呈乳白色或微黃色，表面光滑、無乳清析出、具有酸奶的風(fēng)味、酸甜適中、口感光滑細(xì)膩。

1.5 發(fā)酵乳各項指標(biāo)的檢測

依據(jù)GB5413.3-2010《嬰幼兒食品和乳制品中脂肪的測定》、GB5413.34-2010《乳和乳制品酸度的測定》、GB5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測定方法》、GB4789.18-2010《食品微生物學(xué)檢驗與乳制品檢驗》中要求的方法檢測。

1.5.1 儲藏期內(nèi)發(fā)酵乳乳酸菌總數(shù)的測定

1.5.1.1 檢驗程序

檢驗程序如下。

1.5.1.2 操作步驟

配制MRS-IM瓊脂培養(yǎng)基，按照國標(biāo)方法進(jìn)行乳酸菌計數(shù)[9]。每隔7 d檢測一次活菌總數(shù)。

具體操作步驟如下：以無菌操作的方法取25 g發(fā)酵乳樣品置于裝有225 mL的無菌生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，充分混勻，進(jìn)行10倍遞增稀釋。取2～3個適宜稀釋度，各取1 mL加入無菌培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中加入配制好的MRS培養(yǎng)基15 mL，混勻凝固后，倒放在厭氧盒內(nèi)。裝有該樣品的厭氧盒放入溫度為36℃的恒溫培養(yǎng)箱中，在此溫度條件下培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)后計數(shù)平板上的所有乳酸菌總數(shù)。

1.5.2 儲藏期內(nèi)發(fā)酵乳pH值的測定

pH值由pH計直接測量而得，每隔7 d檢測一次發(fā)酵乳的pH值。

1.5.3 儲藏期內(nèi)發(fā)酵乳黏度的測定

黏度測量前首先將樣品從4℃冰箱中取出，放置在室溫環(huán)境下，待樣品恢復(fù)至室溫時開始測量。各參數(shù)設(shè)置如下：轉(zhuǎn)子類型LV-4；測定轉(zhuǎn)速200 r/min；測定時間1 min。檢測頻率每隔7 d檢測一次。

1.5.4 儲藏期內(nèi)發(fā)酵乳持水力的測定

取待測發(fā)酵乳樣品30 mL于離心管中，并測得樣品的質(zhì)量W0后，放入離心機(jī)中離心，以3 000 r/min離心20 min，取出離心管靜置10 min后，去除上清液，測殘余物的質(zhì)量W，發(fā)酵乳的持水力計算公式如下：

持水力/%=W／W0×100%

2 發(fā)酵乳各項指標(biāo)檢測結(jié)果

2.1 儲藏期內(nèi)乳酸菌活菌總數(shù)檢測結(jié)果

圖1 顯示的是儲藏期4周內(nèi)發(fā)酵乳中乳酸菌活菌總數(shù)的變化情況。從圖1可以看出各試驗組樣品中的乳酸菌活菌數(shù)均多于對照組，說明添加姬松茸多糖的復(fù)合微生態(tài)制劑試驗組對益生菌的生長產(chǎn)生了明顯的促進(jìn)作用，在4周28 d的儲藏期內(nèi)，試驗組和對照組的活菌總數(shù)都達(dá)到了108以上，活菌總數(shù)較高，符合發(fā)酵乳制品食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 19302-2010中乳酸菌數(shù)≥1×106CFU/g(mL)的要求[10]。

圖1 發(fā)酵乳中乳酸菌活菌數(shù)的變化

2.2 儲藏期內(nèi)pH值檢測結(jié)果

圖2 顯示的是4周之內(nèi)發(fā)酵乳樣品的pH值的變化情況。在4周內(nèi)，不管是試驗組還是對照組的發(fā)酵乳樣品的pH值均隨時間延長而呈現(xiàn)下降趨勢，但隨著時間的變化，試驗組和對照組的pH值均未發(fā)生顯著性變化(P＞0.05)。4周貨架期內(nèi)，試驗組發(fā)酵乳樣品的pH值從4.50降到4.30，對照組發(fā)酵乳樣品的pH值從4.55降到4.32，較小的變化表明發(fā)酵菌種在存貯期依然具有較好的產(chǎn)酸能力，并能產(chǎn)生少量的乳酸[11]。

圖2 發(fā)酵乳中pH值的變化

2.3 儲藏期內(nèi)黏度檢測結(jié)果

圖3 顯示的是儲藏期4周內(nèi)發(fā)酵乳的黏度變化情況。從圖3可以看出，各組發(fā)酵乳樣品的黏度與對照組相比，均發(fā)生了不同程度的增加。在整個貯存期間，隨著時間的變化，黏度在整體上有顯著性降低的趨勢(P＜0.05)。發(fā)酵后，牛奶中蛋白酶繼續(xù)催化分解凝膠結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)交聯(lián)被破壞，從而削弱了網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，致使發(fā)酵乳樣品黏度有所降低。

圖3 發(fā)酵乳中黏度的變化

2.4 儲藏期內(nèi)發(fā)酵乳持水力的變化

結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵乳貯藏期內(nèi)持水力的變化

表1 發(fā)酵乳各項指標(biāo)檢測結(jié)果

圖4 顯示的是儲藏期4周內(nèi)發(fā)酵乳持水力的變化情況。從圖4中可以看出，發(fā)酵乳的持水力在7 d內(nèi)下降較快，第7天到第21天變化不明顯，在貯藏期1～7 d內(nèi)隨著發(fā)酵乳的酸度的增大和pH值的降低，對發(fā)酵乳的凝膠結(jié)構(gòu)影響較大，結(jié)構(gòu)中所持的水分相對有較多的析出。第7～21 d隨著酸度和pH值的變化，乳酸菌總數(shù)的減少對發(fā)酵乳的凝膠結(jié)構(gòu)影響也逐漸減小。通過實驗觀察，雖然發(fā)酵乳在貯存期間由于酸度和pH值的變化對其持水力產(chǎn)生影響，但不管是對試驗組還是對照組來說，始終未影響到發(fā)酵乳的整體凝膠效果。

2.5 發(fā)酵乳貯藏期內(nèi)pH值與滴定酸度指標(biāo)的變化

圖5 顯示的是儲藏期4周內(nèi)發(fā)酵乳的pH值和酸度指標(biāo)的變化情況。發(fā)酵乳的酸度和pH值能夠影響產(chǎn)品的質(zhì)量和口感，發(fā)酵乳在4～6℃條件下貯藏1、3、7、15、21 d酸度和pH值的變化非常明顯，從圖5中可以看出，酸度反映了乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的程度，酸度隨著貯藏時間的延長而不斷的增長，從第1天時酸度77 °T增長到了21天時的酸度91 °T，而pH值是發(fā)酵液的表觀H+離子濃度，隨著貯藏時間的延長pH值不斷的下降，從第1天時pH4.50下降到第28天時pH4.30?？梢缘贸鼋Y(jié)論，發(fā)酵乳貯藏時間越長酸度越高，pH值越低,兩者之間有一定的相關(guān)性，但沒有緊密聯(lián)系的規(guī)律性可循。

圖5 發(fā)酵乳貯藏期內(nèi)pH值與酸度指標(biāo)的變化

2.6 發(fā)酵乳感官狀態(tài)的問卷調(diào)查結(jié)果

為了了解發(fā)酵乳樣品的感官指標(biāo)，我們進(jìn)行了發(fā)酵乳樣品的感官評價測試問卷調(diào)查。采用簡單隨機(jī)的抽樣方法，抽取了本校不同專業(yè)的同學(xué)在現(xiàn)場進(jìn)行試驗組和對照組發(fā)酵乳樣品的品嘗，對回收的感官評價評分表共整理出95份有效調(diào)查表，分析其中的數(shù)據(jù)顯示：試驗組和對照組的發(fā)酵乳樣品在口感、滋氣味、組織狀態(tài)、顏色等感官方面均優(yōu)勢明顯，且兩者在以上4個感官指標(biāo)方面并無明顯區(qū)別。

3 討論

通過本試驗發(fā)現(xiàn)，益生元對益生菌的影響作用重大[12]，益生菌添加益生元后制備的發(fā)酵乳與未添加益生元的發(fā)酵乳通過乳酸菌活菌總數(shù)、黏度、pH值檢測、持水力檢測、口感、滋氣味、組織狀態(tài)以及顏色等感官指標(biāo)的檢測結(jié)果可知，添加益生元后活菌總數(shù)增加，猜測可能原因是，姬松茸多糖由葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成[13]，單糖種類的多少可能影響乳桿菌的生長，從而影響發(fā)酵乳的活菌總數(shù)以及黏度值，但并不導(dǎo)致其感官指標(biāo)發(fā)生差異性的變化。

表2 感官評定評分情況統(tǒng)計表

綜上所述，添加益生元（姬松茸多糖）對發(fā)酵乳的發(fā)酵特性產(chǎn)生了影響，在4周儲藏期內(nèi)，試驗組的乳酸菌活菌總數(shù)和黏度值均高于對照組，且符合發(fā)酵乳的國家標(biāo)準(zhǔn)要求，能夠改善機(jī)體的免疫能力。