田青,A.J.Spitzer,Feng-Qi Zhao

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院 淮安223003；2.佛蒙特大學(xué) 伯靈頓05405）

0 引言

牛奶蛋白主要包括αs1-酪蛋白（CSN1S1）、αs2-酪蛋 白（CSN1S2）、β-酪 蛋 白（CSN2）和κ-酪 蛋 白（CSN3）、乳清蛋白（α-LA）和乳球蛋白(β-LG)等。在泌乳過(guò)程中，奶牛乳腺上皮細(xì)胞(MECs)需要先從血液中攝取能量、葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，然后在泌乳激素、信號(hào)通路、細(xì)胞因子等的調(diào)節(jié)下才能完成，如乳葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)需要葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子（GLUT1和GLUT8）的調(diào)節(jié)[1]，泌乳激素作用的發(fā)揮需要有激素受體的調(diào)節(jié)[2-3]，乳腺健康的保持還有炎癥因子的參與等[4]。研究表明，在妊娠晚期到泌乳早期，乳腺上皮細(xì)胞中GLUT1和GLUT8基因的表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)[5]，由LPS引發(fā)的大鼠乳腺上皮細(xì)胞(MMECs)導(dǎo)致各種細(xì)胞因子的表達(dá)，包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)和IL-1β[6]。催乳素（PRL）是促進(jìn)乳腺發(fā)育和維持乳腺正常形態(tài)的重要激素，因此它被視為在體外促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)維持的重要激素之一。為了了解PRL本身對(duì)乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白合成、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子及炎癥因子的影響，進(jìn)而排除它對(duì)后續(xù)開(kāi)展的體外試驗(yàn)研究的干擾，本試驗(yàn)以HC11細(xì)胞為載體，研究了PRL對(duì)乳腺上皮細(xì)胞中主要乳蛋白基因(CSN1S1、CSN2、α-LA)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子（GLUT1和GLUT8）和炎癥因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）基因表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞模型

HC11細(xì)胞，來(lái)自于妊娠中期BALB/c大鼠的細(xì)胞系，由美國(guó)佛蒙特大學(xué)趙鳳啟教授實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 細(xì)胞增殖

采用隨機(jī)分組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)對(duì)照（無(wú)激素）和試驗(yàn)組（5 ug/mL的催乳素），每組2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4個(gè)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

將復(fù)蘇后的HC11細(xì)胞以6×103個(gè)/孔等密度接種于96孔板，先用生長(zhǎng)培養(yǎng)基(CGM：RPMI1640+10% FBS+50 ug/mL gentamicin+5 ug/mL insulin+10 ng/mL EGF)培養(yǎng)至80%貼壁，然后用前激素誘導(dǎo)培養(yǎng)基(PIM：RPMI1640+10% charcoal-treated horse serum+50 ug/mL gentamicin+5 ug/mL insulin)培養(yǎng)24 h后，試驗(yàn)組隨后接著用激素誘導(dǎo)培養(yǎng)基(PIM+0.1μmol/L dexamethasone+5 mg/mL prolactin)培 養(yǎng)20 h（對(duì)照組接著用PIM培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h），之后每孔細(xì)胞加入10 mL MTT標(biāo)記試劑培養(yǎng)4 h后立刻加入增溶試劑100μL繼續(xù)培養(yǎng)24 h，酶標(biāo)儀570 nm讀取吸光度。

1.3 激素誘導(dǎo)試驗(yàn)

為了確定催乳素是否對(duì)HC11細(xì)胞蛋白質(zhì)相關(guān)基因、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子和細(xì)胞因子基因表達(dá)具有誘導(dǎo)作用，試驗(yàn)采用隨機(jī)分組試驗(yàn)設(shè)計(jì)（同細(xì)胞增殖試驗(yàn)設(shè)計(jì)），分別研究了催乳素作用3 h和24 h對(duì)各基因表達(dá)的影響。具體方法同細(xì)胞增殖試驗(yàn)，即HC11細(xì)胞以2×105個(gè)/孔等密度接種于6孔板，即先用生長(zhǎng)培養(yǎng)基(CGM)培養(yǎng)至細(xì)胞80%貼壁，然后用前PIM培養(yǎng)24 h，隨后用PIM和（PIM+5 mg/mL）分別培養(yǎng)對(duì)照組和試驗(yàn)組細(xì)胞3 h和24 h后收獲細(xì)胞，用于測(cè)定各基因表達(dá)。總RNA的提取采用RNeasy Plus Kit(Qiagen)試劑盒并按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，RNA的轉(zhuǎn)錄采用SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase(Invitrogen)試劑盒并按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以GAPDH、β-actin和HPRT為內(nèi)參，采用SYBR green試劑盒并按說(shuō)明書(shū)對(duì)各基因mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析，基因表達(dá)量用2^(-△△CT)法進(jìn)行計(jì)算。各個(gè)基因引物詳見(jiàn)表1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有原始數(shù)據(jù)用SAS 9.1中TUKEY單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

大鼠乳腺上皮細(xì)胞模型是體外研究泌乳、乳成分合成、炎癥影響及其作用機(jī)制等的重要依據(jù)，本試驗(yàn)以大鼠HC11細(xì)胞系為載體，研究了PRL對(duì)大鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖、乳蛋白合成、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子及炎癥因子各基因表達(dá)的影響，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究中試驗(yàn)條件的設(shè)定提供了重要的參考。

2.1 催乳素對(duì)HC11細(xì)胞增殖的影響

由圖1可見(jiàn)，與對(duì) 照組相比，5mg/mL的PRL對(duì)HC11細(xì)胞的增殖無(wú)影響（P＞0.05）。眾所周知，催乳素(prolactin，PRL)是一種分子量為23 ku的單鏈多肽，是由腦垂體分泌的，它最著名的作用是針對(duì)乳腺的，其主要功能包括泌乳的起始和維持，以及調(diào)節(jié)乳腺發(fā)育和分化的[11]。2014年田青等人研究發(fā)現(xiàn)，催乳素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，并且隨著催乳素劑量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中50 ng/mL的劑量促乳腺上皮細(xì)胞的增殖作用最為明顯[12]。在本研究中，與對(duì)照相比，催乳素對(duì)細(xì)胞增殖的影響差異不顯著，主要原因可能是催乳素添加劑量較小造成的。

表1 基因引物信息表

圖1 催乳素對(duì)HC11細(xì)胞增殖的影響

2.2 催乳素對(duì)HC11細(xì)胞中乳蛋白基因表達(dá)的影響

由圖2可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，作用3 h時(shí)，催乳素顯著促進(jìn)了HC11細(xì)胞中β-CN和α-LA基因的表達(dá)（P＜0.05），αS1-CN基因的表達(dá)也明顯增加（約20倍）但差異不顯著（P＞0.05）；但當(dāng)催乳素作用于大鼠乳腺上皮細(xì)胞24 h時(shí)，與對(duì)照組相比，催乳素顯著增加了HC11細(xì)胞αS1-CN，β-CN和α-LA基因的表達(dá)（P＜0.05）。從時(shí)間效應(yīng)來(lái)看，隨著催乳素誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，激素對(duì)乳蛋白相關(guān)基因的誘導(dǎo)作用也增加明顯，24 h時(shí)蛋白基因的表達(dá)量顯著高于3 h的表達(dá)量（P＜0.05）（見(jiàn)圖3）。

圖2 3 h時(shí)催乳素對(duì)相關(guān)酪蛋白基因表達(dá)的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，用5 mg/mL的催乳素處理HC11細(xì) 胞3 h和24 h均 誘 導(dǎo)αS1-CN、β-CN和α-LA基因的表達(dá)（除3 h時(shí)CSN1S1基因表達(dá)量增加了約20倍以外，其他各組均達(dá)到了顯著水平P＜0.01)，說(shuō)明催乳素對(duì)酪蛋白相關(guān)基因的表達(dá)有顯著的誘導(dǎo)作用，也間接說(shuō)明了在泌乳和乳蛋白合成過(guò)程中，催乳素發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。杜瑞平等研究結(jié)果表明，在培養(yǎng)液含瘦素100 ng/mL基礎(chǔ)上,催乳素對(duì)乳蛋白及信號(hào)通路關(guān)鍵因子基因表達(dá)有促進(jìn)作用,但濃度限制在一定范圍(0.1～1.0μg/mL),過(guò)高或過(guò)低都會(huì)呈現(xiàn)抑制效應(yīng)[13]。這與本試驗(yàn)結(jié)果有相同又有不同，相同的是催乳素的確可以促進(jìn)酪蛋白基因的表達(dá)，不同的是劑量效應(yīng)上略有差異，這可能是杜瑞平等的實(shí)驗(yàn)研究中使用了瘦素的原因。激素之間往往關(guān)系緊密，相互影響，有的拮抗，有的協(xié)同，因此兩種激素同時(shí)存在可能會(huì)使結(jié)果有一定的差異。也有其他一些研究表明，泌乳激素復(fù)合物（INS、PRL和GCs）可以誘導(dǎo)β-CN和α-LA基因表達(dá)，這也和本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，催乳素誘導(dǎo)乳蛋白合成具有時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，隨著催乳素誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，激素對(duì)乳蛋白相關(guān)基因的誘導(dǎo)作用也增加明顯，24 h時(shí)蛋白基因的表達(dá)量顯著高于3 h的表達(dá)量（P＜0.05）。

圖3 24 h時(shí)催乳素對(duì)酪蛋白基因表達(dá)的影響

2.3 催乳素對(duì)HC11細(xì)胞中GLUTs基因表達(dá)的影響

圖4 3 h時(shí)催乳素對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)的影響

由圖4可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，作用3 h時(shí)，催乳素有增加GLUT1和GLUT8基因表達(dá)的趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）；但作用24 h時(shí)，催乳素對(duì)GLUTs基因表達(dá)依然無(wú)影響（P＞0.05），但和3 h時(shí)相比，GLUT1基因表達(dá)量上升程度要比GLUT1快（圖5）。宗燦華等研究結(jié)果表明，GLUT1是一個(gè)隨泌乳期的變化而動(dòng)態(tài)變化的基因。該基因的表達(dá)妊娠期開(kāi)始升高，整個(gè)泌乳期持續(xù)高表達(dá)，泌乳140 d達(dá)到峰值，此后開(kāi)始下降。妊娠晚期和泌乳期，GLUT1主要定位在乳腺上皮細(xì)胞基底側(cè)細(xì)胞膜和頂膜，這說(shuō)明奶牛乳腺主要通過(guò)GLUT1吸收葡萄糖為乳腺發(fā)育和泌乳提供能量和底物[14]，這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。但也有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小鼠乳腺上皮細(xì)胞系HC11或牛原代乳腺上皮細(xì)胞中，GLUTs的表達(dá)并沒(méi)有隨著泌乳激素處理而增加，但泌乳激素卻明顯刺激乳蛋白和脂質(zhì)基因的表達(dá)[15]，這更加證實(shí)了催乳素調(diào)控泌乳和乳蛋白合成與分泌的功能。

圖5 24 h時(shí)催乳素對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)的影響

圖6 3 h時(shí)催乳素對(duì)細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

圖7 24 h時(shí)催乳素對(duì)細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

2.4 催乳素對(duì)HC11細(xì)胞中細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

由圖6可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，3 h時(shí)催乳素有降低細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α基因表達(dá)的趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）；由圖7可見(jiàn)，隨著催乳素作用時(shí)間的延長(zhǎng)，與對(duì)照組相比，24 h時(shí)催乳素對(duì)細(xì)胞因子的基因表達(dá)無(wú)影響（P＞0.05）。從時(shí)間效應(yīng)來(lái)看，隨著催乳素誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，各細(xì)胞因子基因表達(dá)也在下降。

眾所周知，TNF-α是由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)、組織損傷、休克等生理性和病理性反應(yīng)雙重作用，細(xì)菌和病毒入侵可以誘導(dǎo)機(jī)體表達(dá)過(guò)量TNF-α，IL-6主要由成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生[16]。IL-1β又稱(chēng)淋巴細(xì)胞活化因子，也是由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在組織炎癥狀態(tài)下發(fā)揮著重要功能。IL-6它可以誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞增殖分化，增強(qiáng)自然殺傷（NK）細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴（CTL）細(xì)胞的活性參與炎癥反應(yīng)[17]。有研究結(jié)果表明，不同濃度LPS刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA相對(duì)表達(dá)水平隨著LPS刺激濃度的增加而增加，說(shuō)明IL-1β、IL-6在炎癥反應(yīng)中會(huì)被激活以起到抗炎作用[18]。這看似與本試驗(yàn)中PRL對(duì)3種細(xì)胞因子表達(dá)的影響不符合，實(shí)際上也并不矛盾。在本試驗(yàn)中，選用的是健康的大鼠HC11細(xì)胞，催乳素的添加只是模擬了動(dòng)物泌乳過(guò)程中體內(nèi)激素的正常生理變化，而各細(xì)胞因子的高表達(dá)主要體現(xiàn)在炎癥狀態(tài)下的抗炎作用的體現(xiàn)，此試驗(yàn)中的大鼠健康乳腺中本就不該有細(xì)胞因子的高表達(dá)，因此說(shuō)明本試驗(yàn)研究的結(jié)果是可信的。

3 結(jié)論

5 mg/mL的催乳素不影響細(xì)胞增殖和炎癥因子的基因表達(dá)，但顯著誘導(dǎo)了乳蛋白基因的表達(dá)，說(shuō)明催乳素誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞模型更適合于對(duì)乳蛋白合成和分泌有負(fù)面影響因素及作用機(jī)制研究，否則則需要排除PRL干擾。