謝南昌，杜麗媛，連亞軍，王 翠，孟祥荷，李鈺娟，劉鳳霞

近年研究指出線粒體功能障礙可能是癲癇的核心發(fā)病機(jī)制，并與癲癇神經(jīng)元選擇易損性密切相關(guān)[1]。線粒體未折疊蛋白反應(yīng)(mitochondrial unfolded protein response,mtUPR)作為新發(fā)現(xiàn)的線粒體蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)，是指在各種應(yīng)激條件下，線粒體為了維持其蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，啟動(dòng)由核DNA編碼的線粒體熱休克蛋白和蛋白酶等基因群轉(zhuǎn)錄活化程序的應(yīng)激反應(yīng)[2]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，線粒體基質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)積累可造成AP-1選擇性誘導(dǎo)CHOP而導(dǎo)致線粒體內(nèi)熱休克蛋白HSP60、mtDnaJ和線粒體蛋白酶ClpP表達(dá)量升高[3]。因此，mtUPR可及時(shí)感知線粒體內(nèi)蛋白穩(wěn)態(tài)破壞，幫助折疊蛋白恢復(fù)正常蛋白構(gòu)象及協(xié)助新合成蛋白正確折疊，防止損害繼續(xù)擴(kuò)大[4]。最近，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)在癲癇動(dòng)物模型及顳葉癲癇患者中海馬神經(jīng)元HSP60表達(dá)水平明顯升高[5]。

線粒體自噬是一種選擇性的自噬過程，是降解損傷線粒體，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和線粒體功能的一種重要途徑。但過度或者紊亂的線粒體自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體過度降解從而引起細(xì)胞能量代謝障礙，甚至細(xì)胞死亡。近年研究發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)mtUPR的刺激也最終能夠誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生[6]。以往研究發(fā)現(xiàn)線粒體自噬抑制劑Mdivi-1在癲癇海馬神經(jīng)元中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[7]，但其對(duì)線粒體未折疊蛋白反應(yīng)的作用仍然未知。

本研究中，我們利用體外海馬神經(jīng)元癲癇模型觀察海馬神經(jīng)元CHOP、HSP60和ClpP的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，從線粒體未折疊蛋白反應(yīng)角度探討癲癇神經(jīng)損傷的可能機(jī)制；并進(jìn)一步探討線粒體自噬抑制劑Mdivi-1對(duì)線粒體未折疊蛋白反應(yīng)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)試劑 新生24 h以內(nèi)健康SD大鼠，SPF級(jí)。試劑：無(wú)鎂外液(2.5 mmol/L KCl、145 mmol/L NaCl、10 mmol葡萄糖、0.002 mmol/L甘氨酸、2 mmol/L CaCl2和10 mmol/L HEPES，pH 7.4)；正常細(xì)胞外液(無(wú)鎂外液各成分+1 mmol/L MgCl2)；PBS液；RIPA裂解緩沖液；線粒體熒光探針MitoSOX(Invitrogen)；Rhodamine123(Sigma)；β-actin、CHOP、線粒體內(nèi)熱休克蛋白HSP60、線粒體蛋白酶ClpP、CytC和caspase-3抗體(CST)；線粒體自噬抑制劑Mdivi-1(Abcam)。

1.2 原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng) 新生24 h內(nèi)的SD大鼠，用酒精消毒后，斷頭取腦，將其放置加有預(yù)冷PBS的培養(yǎng)皿中，在無(wú)菌條件下分離雙側(cè)海馬組織并將其表面血管剔除后，剪成約1 mm3的組織塊至15 ml離心管中，加入0.125%的胰酶在37 ℃恒溫箱消化15 min，期間輕微震蕩數(shù)次后加入PBS洗滌并終止消化，以1500 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min后棄上清，用PBS洗滌后加入種植培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個(gè)/孔接種于預(yù)先用0.01% L-多聚賴氨酸包被的6孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃恒溫箱、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后等量更換為維持培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，之后每2 d半量更換維持培養(yǎng)液培養(yǎng)至14 d即可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.3 大鼠海馬神經(jīng)元癲癇模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組

1.3.1 造模 用維持培養(yǎng)液培養(yǎng)至14 d后，棄去維持培養(yǎng)液，用無(wú)鎂外液沖洗3次后加入無(wú)鎂外液培養(yǎng)3 h誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元癲癇模型。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 將原代海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為：(1)對(duì)照組(CON組)：正常細(xì)胞外液處理神經(jīng)元3 h后繼續(xù)用維持培養(yǎng)液培養(yǎng)；(2)無(wú)鎂誘導(dǎo)組(AE組)：用無(wú)鎂外液分別處理神經(jīng)元3 h、12 h、24 h后繼續(xù)用維持培養(yǎng)液培養(yǎng)；(3)AE+DMSO組(陰性對(duì)照組)：用5 μl DMSO處理神經(jīng)元30 min后繼續(xù)用維持培養(yǎng)液培養(yǎng)，最后用無(wú)鎂外液分別處理神經(jīng)元3 h；(4)AE+Mdivi-1組：將25 μmol Mdivi-1溶解于5 μl DMSO中處理神經(jīng)元30 min后繼續(xù)用維持培養(yǎng)液培養(yǎng)，最后用無(wú)鎂外液分別處理神經(jīng)元3 h。

1.4 神經(jīng)元純度檢測(cè) 海馬神經(jīng)元在放置有爬片的24孔板中生長(zhǎng)至7 d可進(jìn)行NSE染色鑒定神經(jīng)元純度。棄去培養(yǎng)液，用PBS漂洗一遍后用4%多聚甲醛固定30 min后，PBS漂洗3次，每次5 min；然后用0.2% TritonX-100破膜5 min，吸棄TritonX-100后，用PBS漂洗3次，每次5 min；加入兔抗大鼠NSE多克隆抗體4 ℃過夜，TBST漂洗3次，每次5 min；加入山羊抗兔熒光二抗，避光孵育1 h，TBST漂洗3次，每次5 min；滴加10 μl含DAPI的抗熒光衰減封片劑于載玻片上，取出細(xì)胞爬片并蓋在載玻片上。在400倍熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野觀察，計(jì)算NSE陽(yáng)性細(xì)胞率并取均值即為神經(jīng)元純度。

1.5 線粒體ROS生成水平檢測(cè) 利用線粒體熒光探針MitoSOX評(píng)估線粒體ROS生成水平。胰蛋白酶處理原代小膠質(zhì)細(xì)胞，然后用5 μmol/L MitoSOX工作液37 ℃避光孵育15 min，PBS清洗，再通過流式細(xì)胞術(shù)來(lái)評(píng)估線粒體ROS生成水平，結(jié)果通過各單位的熒光強(qiáng)度來(lái)表示。

1.6 線粒體膜電位水平檢測(cè) 利用Rhodamine123檢測(cè)線粒體膜電位水平。棄去細(xì)胞上清液后用PBS緩沖液清洗，然后加入Rhodamine123染液5 μg/ml，置于37 ℃、5% CO2孵育箱中孵育10 min，PBS清洗后，用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估線粒體膜電位水平，結(jié)果通過Rhodamine123的熒光強(qiáng)度來(lái)表示。

1.7 Western blotting分析 檢測(cè)CHOP、HSP60、ClpP、CytC、caspase-3蛋白表達(dá)水平。加入RIPA裂解緩沖液裂解各組海馬神經(jīng)元提取蛋白，BCA法檢測(cè)各組蛋白濃度，調(diào)整上樣體積至每個(gè)泳道蛋白量相等；12% SDS-PAGE凝膠電泳(上層膠80 V 30 min，下層膠120 V 90 min)，電泳結(jié)束后將膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉2 h；一抗β-actin(1∶3000)、CHOP(1∶500)、HSP60(1∶1000)、ClpP(1∶1000)、CytC(1∶1000)、caspase-3(1∶500)孵育，4 ℃過夜；10% TBST洗膜3次，每次10 min；二抗常溫孵育1 h，10% TBST洗膜3次，每次10 min；最后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法觀察。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)元純度檢測(cè) 體外原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元(見圖1A)，并對(duì)神經(jīng)元采用NSE免疫熒光染色后，在熒光顯微鏡下可觀察到其胞質(zhì)和樹突著紅色熒光，胞核著藍(lán)色熒光。結(jié)果(見圖1B)所示，在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野觀察并計(jì)數(shù)，計(jì)算其均數(shù)得神經(jīng)元純度在95%以上。

A：體外原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元；B：NSE染色海馬神經(jīng)元

2.2 癲癇海馬神經(jīng)元CHOP、HSP60和ClpP表達(dá)變化 與對(duì)照組相比，AE組(3 h、12 h、24 h)CHOP和HSP60蛋白的表達(dá)量均顯著增多，且在12 h內(nèi)，CHOP表達(dá)量與時(shí)間呈正相關(guān)，12 h后有所下降。與對(duì)照組相比，AE組(3 h、12 h、24 h)ClpP蛋白的表達(dá)量均顯著增加，且與時(shí)間呈正相關(guān)。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

圖2 癲癇海馬神經(jīng)元CHOP、HSP60和ClpP表達(dá)變化

2.3 Mdivi-1對(duì)線粒體未折疊蛋白反應(yīng)的影響 與AE組相比，Mdivi-1使海馬神經(jīng)元CHOP、HSP60和ClpP的表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖3)。與AE組相比，DMSO組(陰性對(duì)照組)CHOP、HSP60和ClpP表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05，見圖3)。

圖3 Mdivi-1對(duì)海馬神經(jīng)元CHOP、HSP60和ClpP表達(dá)變化的影響

2.4 Mdivi-1對(duì)海馬神經(jīng)元線粒體ROS生成及線粒體膜電位影響 與對(duì)照組相比，AE組海馬神經(jīng)元線粒體ROS生成增多以及線粒體膜電位降低(P<0.05，見圖4)。與AE組相比，Mdivi-1使海馬神經(jīng)元線粒體ROS生成顯著減少，線粒體膜電位增加(P<0.05，見圖4)。與AE組相比，DMSO組海馬神經(jīng)元線粒體ROS生成及線粒體膜電位無(wú)顯著差異(P>0.05，見圖4)。

圖4 A：各組海馬神經(jīng)元線粒體ROS生成變化；B：各組海馬神經(jīng)元線粒體膜電位變化

2.5 Mdivi-1對(duì)海馬神經(jīng)元CytC水平及caspase-3激活的影響 與對(duì)照組相比，AE組海馬神經(jīng)元cyto-CytC水平升高并且caspase-3激活增加，而mito-CytC水平降低(P<0.05，見圖5)。與AE組相比，Mdivi-1使海馬神經(jīng)元cyto-CytC水平降低且caspase-3激活減弱，而mito-CytC水平升高(P<0.05，見圖5)。AE組和DMSO組海馬神經(jīng)元CytC水平及caspase-3激活無(wú)顯著差異(P>0.05，見圖5)。

圖5 各組海馬神經(jīng)元CytC水平及caspase-3激活變化

3 討 論

本研究證實(shí)癲癇海馬神經(jīng)元中線粒體未折疊蛋白反應(yīng)增強(qiáng)，并且線粒體自噬抑制劑Mdivi-1可以通過增強(qiáng)線粒體未折疊蛋白反應(yīng)對(duì)癲癇海馬神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Mdivi-1可以減少線粒體ROS生成以及恢復(fù)線粒體膜電位，并且Mdivi-1通過減少CytC釋放和caspase-3的激活從而減少海馬神經(jīng)元凋亡，這些研究發(fā)現(xiàn)為癲癇治療提供了新思路。

線粒體蛋白正確折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)維持線粒體功能至關(guān)重要[8,9]。研究表明癲癇發(fā)作可引起線粒體氧化呼吸鏈損傷，ROS水平上升，ATP水平下降，線粒體跨膜電位下降及Ca2+紊亂等線粒體功能障礙[10]。另外研究發(fā)現(xiàn)線粒體氧化應(yīng)激會(huì)降低線粒體導(dǎo)入效率，從而導(dǎo)致線粒體蛋白質(zhì)量控制失衡，并且大量ROS會(huì)干擾線粒體蛋白質(zhì)折疊環(huán)境從而觸發(fā)mtUPR[11,12]。研究表明在應(yīng)激環(huán)境下HSP60水平升高能促進(jìn)線粒體蛋白質(zhì)高效折疊，其主要折疊相對(duì)較小的，可溶性的單體蛋白[13,14]。而CLpP能識(shí)別錯(cuò)誤折疊的蛋白并將其降解為8～20個(gè)氨基酸的多肽[15]。本研究結(jié)果顯示癲癇海馬神經(jīng)元較對(duì)照組CHOP、HSP60和CLpP表達(dá)量顯著增加，提示癲癇海馬神經(jīng)元mtUPR被激活，并可通過mtUPR恢復(fù)線粒體蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和維持線粒體正常功能。

線粒體受損時(shí)，除了mtUPR被激活，PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬途徑也被激活[16]。研究表明當(dāng)線粒體導(dǎo)入效率輕微受損即可激活mtUPR，而PINK1需要在線粒體外膜上大量積累才可激活線粒體自噬[17,18]。這提示線粒體損傷較輕時(shí)，優(yōu)先激活mtUPR來(lái)恢復(fù)線粒體功能。當(dāng)線粒體損傷較重時(shí)，線粒體自噬相關(guān)的PINK1和Parkin與HSP60互動(dòng)關(guān)閉mtUPR，并激活線粒體自噬，清除受損嚴(yán)重的線粒體。本研究發(fā)現(xiàn)粒體自噬抑制劑Mdivi-1可增加癲癇海馬神經(jīng)元CHOP、HSP60和CLpP表達(dá)量，使線粒體ROS生成減少、線粒體膜電位恢復(fù)，并減少CytC釋放和caspase-3激活，提示抑制線粒體自噬可通過增強(qiáng)mtUPR來(lái)使過度受損的線粒體恢復(fù)正常功能，并且進(jìn)一步減少海馬神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，在無(wú)鎂外液致癇海馬神經(jīng)元中mtUPR被激活，并且線粒體自噬抑制劑Mdivi-1可通過增強(qiáng)mtUPR發(fā)揮癲癇神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過減少線粒體ROS生成、恢復(fù)線粒體膜電位及減少CytC釋放和caspase-3激活發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，這也表明mtUPR有望成為癲癇治療的新靶點(diǎn)。