林 蓁 楊文圣 尹可能

世界因肝癌致死的病例占惡性腫瘤死亡原發(fā)性的第3位，我國居第2位。每年約有25萬人死于此病，其中約40%發(fā)生在中國[1]。通過阻斷腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸最終殺滅肝癌細(xì)胞的免疫治療，可能是目前已知最具臨床前景能較完全殺滅肝癌細(xì)胞的治療手段。本文通過PD-L1檢測探討其在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌表達(dá)情況及在免疫治療上意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集廈門大學(xué)附屬成功醫(yī)院2017年10月至2019年10月間，經(jīng)病理診斷確診為原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌病例95例做測試組，其中男性77例，女性18例，年齡26～84歲，平均年齡56歲。 經(jīng)病理診斷確診為肝臟良性腫瘤病例20例做對照組，其中男性9例，女性11例，年齡22～83歲，平均年齡45歲。扁桃體組織10例及試劑盒內(nèi)陽性、陰性細(xì)胞片做試劑內(nèi)對照組。

1.2 主要儀器

Dako公司 Autostainer Link 48自動免疫組織化學(xué)染色儀 、全自動免疫組化預(yù)處理儀(PT Link，PT200)。

1.3 主要試劑

Dako公司EnVinsion FLEX(PD-L1 IHC 22C3)套裝試劑盒：包括Linker Anti-Mouse、DAB Enhancer、VisualizationI Reagent-HRP、Monoclonal Mouseanti-PD-L1 Clone 22C3、Peroxidase-Blocking Reageagent、Negative Control Reagent、Target Retrieval Solution Low pH(50×)、DAB+Chromogen、DAB+Substrate Buffer、 Control Slides等試劑。

1.4 組織蠟塊切片

取上述測試組、對照組組織蠟塊，將蠟塊3 μm切片各兩張，裱在防脫載玻片上，所有蠟塊均分蠟塊檢測組、蠟塊陰性對照組，組織切片65 ℃烤片30 min，二甲苯脫蠟，經(jīng)梯度乙醇至水化后待用。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

1.5.1 免疫組織切片抗原修復(fù) 使用Dako 全自動免疫組化預(yù)處理儀，進(jìn)行組織切片及細(xì)胞片抗原修復(fù)。程序：根據(jù)編輯程序打印相關(guān)條形碼，蠟塊測試及蠟塊陰性對照片各一張，每例病例分組貼好不同條形碼。將EDTA (pH 9.0，50×)組織修復(fù)液裝入自動免疫組化預(yù)處理儀中扣上儀器蓋，按啟動鍵將修復(fù)液加熱預(yù)溫到65 ℃后，打開儀器蓋將組織切片及細(xì)胞片浸沒入修復(fù)液中，繼續(xù)啟動預(yù)處理程序進(jìn)行98 ℃ 20 min的抗原修復(fù)；程序結(jié)束后，將組織切片及細(xì)胞片pH 7.2～7.4 PBS緩沖液洗滌3 min，蒸餾水洗滌1 min。

1.5.2 免疫組化PD-L1(22C3)蛋白檢測 使用Dako Autostainer Link 48自動免疫組織化學(xué)染色儀，Dako EnVinsion FLEX(PD-L1 IHC 22C3)套裝試劑盒上機(jī)檢測(室溫22～25 ℃)，染色主要步驟：將已經(jīng)修復(fù)好的組織切片及細(xì)胞片上機(jī)掃描開始染色，內(nèi)源性過氧化物酶封閉5 min，pH 7.2～7.4 Buffer沖洗；一抗PD-L1(22C3)室溫孵育30 min(陰性對照片不需要加一抗)，pH 7.2～7.4 Buffer沖洗1 min；二抗室溫孵育30 min，pH 7.2～7.4 Buffer沖洗1 min；VisualizationI Reagent-HRP室溫孵育30 min，pH 7.2～7.4 Buffer沖洗1 min；DAB室溫顯色5 min×2；pH 7.2～7.4 Buffer沖洗1 min；擴(kuò)大劑室溫5 min；pH 7.2～7.4 Buffer沖洗1 min；蘇木精復(fù)染 1 min，無水乙醇脫水，電吹風(fēng)微風(fēng)吹干，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析，比較肝臟良、惡性腫瘤檢測陽性百分率差異性，計數(shù)資料采用卡方χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

由2名高年資醫(yī)師共同判讀結(jié)果，PD-L1(22C3)免疫組化標(biāo)記陽性定位在腫瘤細(xì)胞膜，實(shí)驗根據(jù)腫瘤比例評分(TPS)為判讀標(biāo)準(zhǔn)，指部分或完整膜染色的腫瘤細(xì)胞占樣品中存在的所有活腫瘤細(xì)胞的百分比(PD-L1染色陽性腫本組瘤細(xì)胞數(shù)/總活腫瘤陰性和陽性細(xì)胞數(shù))，判讀中應(yīng)排除任何免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、壞死細(xì)胞的陽性表達(dá)。判讀前，先對扁桃體組織、陽性、陰性細(xì)胞片及蠟塊陰性對照片等進(jìn)行評估，符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)后，再繼續(xù)進(jìn)行判讀。測試組cutoff值，TPS≥1%為陽性，有9例，其中PD-L1高表達(dá)，有2例；TPS：1%～49%低表達(dá)，有5例。cutoff值，TPS<1%或無腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1蛋白為陰性，有87例。 PD-L1蛋白陽性表達(dá)及表達(dá)強(qiáng)度，與腫瘤分化程度無明顯相關(guān)性。對照組：20例良性病例，cutoff值TPS<1%或無腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1蛋白，均為陰性。測試組與對照組，PD-L1蛋白檢測陽性表達(dá)差別顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

相關(guān)肝細(xì)胞肝癌PD-L1研究的文獻(xiàn)不少，免疫組化檢測PD-L1作為肝細(xì)胞肝癌的免疫治療生物學(xué)靶點(diǎn)是很有前景[2]。目前針對PD1/PD-L1通路阻斷劑在肝癌治療中的作用的臨床研究亦很多，研究編號有：NCT02576509、NCT02837029、NCT02702401、NCT0265-8019等[3]。有Truong等[4]有相關(guān)報道，一老年男性轉(zhuǎn)移性HCC患者，Sorafinib治療后失敗，接受6個周期Pembrolizumab治療后，腫瘤大小明顯減小，甲胎蛋白明顯下降，此類病例提示Pembrolizumab等免疫治療有望為晚期HCC患者帶來新的福音。

PD-L1表達(dá)水平目前是受到廣泛認(rèn)可的PD1/PD-L1抑制劑療效預(yù)測標(biāo)志物，但PD-L1檢測存在缺乏一致性與檢測金標(biāo)準(zhǔn)的缺陷[5]。肝細(xì)胞肝癌PD-L1靶向治療的伴隨診斷判讀閾值等亦尚未達(dá)到比較統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，目前有文獻(xiàn)在肝細(xì)胞肝癌采用其它腫瘤的評判標(biāo)準(zhǔn)[2]。不同藥商廠家使用免疫治療藥物進(jìn)行臨床試驗時，采用不同廠家PD-L1抗體，并在不同平臺上進(jìn)行，沒有統(tǒng)一的抗體型號、統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的檢測平臺、統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒。由于PD-L1抗體類型的多樣性，國內(nèi)使用的PD-L1抗體有多個克隆號包括22C3、SP142、SP263、73-10等，染色方法和染色平臺也缺乏規(guī)范化和統(tǒng)一性。PD-L1的表達(dá)與免疫治療的療效顯著相關(guān)，可作為篩選免疫治療潛在獲益人群的一項指標(biāo)，由此獲得準(zhǔn)確、可靠的PD-L1檢測結(jié)果對免疫治療的選擇至關(guān)重要[6]。為了節(jié)約極為有限的腫瘤標(biāo)本，節(jié)約檢測費(fèi)用與檢測次數(shù)，縮短無意義重復(fù)檢測所耗費(fèi)的時間，臨床迫切希望得到各檢測抗體之間的相關(guān)性及一致性研究結(jié)果，從而使PD-L1檢測的臨床應(yīng)用及其治療決策的指導(dǎo)變得更為簡便[7]。

由于免疫治療抗PD-L1藥物需要應(yīng)用于臨床與治療主要依據(jù)免疫染色相關(guān)的PD-L1檢測結(jié)果，因此PD-L1檢測更需要提高其規(guī)范化和重復(fù)性。關(guān)于PD-L1檢測，需要專門的檢測平臺，專門克隆號的抗體及配套的試劑盒，專門的培訓(xùn)及規(guī)范的檢測流程。本次實(shí)驗我們選擇Dako North America 的“PD-L1”(22C3)檢測試劑盒(免疫組化法)，這也是目前在中國獲批的PD-L1檢測試劑盒。其中抗體22C3，常作為其它抗體的參照法[2]。同時我們使用與之配套的檢測平臺Dako Autostainer Link 48免疫組化染色儀，這也從最基礎(chǔ)前提上保證實(shí)驗檢測的可行性，結(jié)果準(zhǔn)確的基本保證。

22C3抗體染色腫瘤組織，以任意膜染色強(qiáng)度(≥1%)為陽性指標(biāo)，根據(jù)腫瘤比例評分(TPS)的3個等級(TPS<1%：PD-L1不表達(dá)；TPS 1%～49%：PD-L1低表達(dá)；TPS≥50%：PD-L1高表達(dá))作為Pembrolizumab的用藥指標(biāo)[8]。不同醫(yī)師判讀結(jié)果可能導(dǎo)致不同的治療選擇，因此真實(shí)臨床實(shí)踐中應(yīng)加強(qiáng)規(guī)范化檢測、嚴(yán)謹(jǐn)統(tǒng)一的判讀標(biāo)準(zhǔn)及對病理醫(yī)師進(jìn)行判讀標(biāo)準(zhǔn)的培訓(xùn)[6]。結(jié)果的判讀在光學(xué)顯微鏡下觀察，先確定陰性、陽性對照表達(dá)定位正確清晰易辨，才可對檢測標(biāo)本進(jìn)行判讀，作為對照組的扁桃體組織PD-L1標(biāo)記要求不同程度中等強(qiáng)度的表達(dá)。對腫瘤細(xì)胞數(shù)量較少的穿刺標(biāo)本，判讀的腫瘤細(xì)胞必須不少于100個。對定位或顯色不正確的病例應(yīng)重新進(jìn)行標(biāo)記，如周邊效應(yīng)。目前PD-L1檢測主要在組織標(biāo)本上進(jìn)行，因其表達(dá)具有異質(zhì)性，檢測時應(yīng)優(yōu)先選擇手術(shù)標(biāo)本；如果患者不能進(jìn)行手術(shù)切除，也可考慮穿刺組織標(biāo)本；當(dāng)腫瘤發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的，選擇復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的標(biāo)本。實(shí)驗肝細(xì)胞肝癌PD-L1的檢測結(jié)果顯示，PD-L1表達(dá)于陽性病例中有高分化、中分化及低分化病例，PD-L1強(qiáng)度與腫瘤分化程度無明顯相關(guān)性，低分化病例PD-L1表達(dá)不一定強(qiáng)陽性，高分化PD-L1表達(dá)也不一定弱陽性。

為保證實(shí)驗質(zhì)量進(jìn)行反復(fù)預(yù)試驗，需有經(jīng)過一定數(shù)量的組織檢測，優(yōu)化程序以探索最佳的染色方案。我們使用Autostainer Link 48自動免疫組織化學(xué)染色儀，及 Dako EnVinsion FLEX(PD-L1 IHC 22C3)套裝試劑盒，為實(shí)驗規(guī)范化提供最基礎(chǔ)的保障。全自動免疫組化預(yù)處理儀(PT Link，PT200)對組織切片進(jìn)行98 ℃ 20 min組織抗體修復(fù)，效果較佳。免疫組化程序中DAB顯色進(jìn)行2次重復(fù)顯色步驟，既保證顯色充分也防止DAB非特異性顆粒吸附，效果較單次DAB顯色佳。本文通過對原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌進(jìn)行PD-L1規(guī)范化免疫組化標(biāo)記，了解PD-L1在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)的特征，這將對臨床在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的免疫治療研究具有十分重要的意義。