韓文莉，趙學科，張立國，雷玲玲，孟超龍，胡守佳，程 錕，王盼盼，鐘 侃，胡景峰，宋 昕，王 偉，李欣然，楊苗苗，徐瑞華，魏夢霞，李志強，劉太江，張高富，李秀敏，陳志國，王立東

食管癌發(fā)病率在上消化道腫瘤中居第2位[1]，我國是食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，顯著的地域性分布差異是我國食管癌突出的流行病學特征之一，河南、河北和山西交界的太行山地區(qū)食管癌尤為高發(fā)[2]。食管癌患者早期無特異癥狀，缺乏高危人群預(yù)警篩查和早期發(fā)現(xiàn)的有效指標和方法，導致其預(yù)后極差，中晚期5 a生存率僅為20%左右[3]。食管癌液體活檢是近年提出的一種腫瘤無創(chuàng)診斷技術(shù)，主要包括腫瘤相關(guān)抗原和蛋白檢測、高易感基因及其蛋白產(chǎn)物檢測、游離循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)檢測、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)檢測、外泌體及循環(huán)RNA(Circulating RNA)檢測等。食管癌是一個多階段演進的過程，隨著疾病的進展，這些標志物會釋放入血，通過分析血液中這些小分子標志物，來實現(xiàn)腫瘤的早期篩查、分子分型、預(yù)后、用藥指導以及復發(fā)監(jiān)測等。本研究通過檢測血清中自身抗體，對高發(fā)區(qū)無癥狀人群進行多中心篩查應(yīng)用，為無癥狀高危人群預(yù)警篩查提供重要依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

①收集100例原發(fā)性早期食管癌患者的血清(食管癌組)以及100例正常人的血清(對照組)。100例早期食管癌患者中，男性54例，女性46例，年齡39～77(60.4±7.4)歲；100例正常人中，男性50例，女性50例，年齡35～69(51.9±9.8)歲。所有食管癌患者血清都是在術(shù)前收集，診斷時間為2010年1月至2015年12月。正常人血清來自門診胃鏡并經(jīng)活檢病理確診為非癌或非癌前病變的健康人群。②接受流行病學調(diào)查的431位無癥狀居民來自新鄉(xiāng)市輝縣市食管癌高發(fā)區(qū)，男性230例，女性201例，年齡35～81(52.1±9.2)歲，中位年齡51歲。流行病學調(diào)查和血液樣品的收集由衛(wèi)生院檢驗科醫(yī)師和當?shù)卮甯刹亢痛遽t(yī)協(xié)助完成。所有研究對象均排除影響血清自身抗體表達的疾病，如感染、過敏及自身免疫性疾病等。③大規(guī)模應(yīng)用人群為2014年至2019年新鄉(xiāng)市輝縣市35歲以上無癥狀者，均無自身免疫性疾病。

1.2 實驗方法

1.2.1 血液樣品的收集及保存對所選取的研究對象取靜脈血5 mL(空腹)置于離心管中，室溫靜置30 min后，2 000 r·min-1離心20 min，每管吸取血清100L進行分裝，放置液氮中保存，而后轉(zhuǎn)-80 ℃冰箱。

1.2.2 血清自身抗體檢測應(yīng)用美國Scripps研究所提取和純化的MDM2、GST和STAT3 3種抗原聯(lián)合檢測收集的血清標本。使用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)，各包被抗原的稀釋終濃度為0.5g·L-1，血清標本稀釋濃度為1∶100，辣根過氧化物酶標記的抗人IgG稀釋濃度為1∶3 000。在ELISA板孔中加入稀釋后的抗原每孔100L，4 ℃，過夜。加入稀釋后的血清每孔100L，每個樣品同步設(shè)置2個復孔，37 ℃孵育1 h。陽性對照為已知陽性血清，陰性對照為包被緩沖液。先加入稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗人IgG 每孔100L，37 ℃孵育30 min；再加入TMB底物顯色液，每孔100L，37 ℃避光反應(yīng)10 min，直至陽性對照顏色明顯變化后，每孔再加入終止液50L，終止反應(yīng)，并在ELISA 檢測儀上讀取OD450光密度值。

1.2.3 血清自身抗體檢測結(jié)果判定采用Scripps研究所判定方法，即正常血清OD讀數(shù)均數(shù)±3個標準差，為Cut-off值(截斷值)，大于此值為陽性，小于此值為陰性[4-5]。

1.2.4 食管內(nèi)鏡檢查和黏膜活檢對血清學檢測陽性者(3種自身抗體中有至少1種為陽性)進行內(nèi)鏡檢查，并常規(guī)在食管中段、下段各取1～2塊活檢組織，并在肉眼可見的病變處隨機取材，必要時行碘染色。在食管不染區(qū)取材，并均迅速置95%乙醇固定。常規(guī)脫水包埋后連續(xù)切片9張(厚5m)，其中1張作HE核實組織診斷，剩余8張作免疫組化。

1.2.5 病理組織學和免疫組化檢查將食管上皮根據(jù)細胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)分為正常、癌前病變和食管癌。采用免疫組化法檢測食管組織中上述3種相關(guān)抗體。免疫蛋白陽性反應(yīng)主要定位于細胞質(zhì)或細胞核，為棕黃色或棕褐色，高倍鏡下視野中無陽性細胞或陽性細胞數(shù)<10%為陰性；陽性細胞數(shù)≥10%為陽性。

2 結(jié)果

2.1 各指標的陽性表達率食管癌和對照組人群血清自身抗體陽性檢出率差異顯著，見表1。3種自身抗體聯(lián)合檢測價值最高，見表2。

表1 兩組血清自身抗體MDM2、GST、STAT3陽性檢出率比較

表1 兩組血清自身抗體MDM2、GST、STAT3陽性檢出率比較

表2 各指標的診斷價值

2.2 腫瘤相關(guān)抗原自身抗體檢測和食管內(nèi)鏡檢查結(jié)果應(yīng)用酶聯(lián)免疫測定法共檢測431例食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀居民血清3種腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體水平，受檢人群的基本特征見表3。結(jié)果3個腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體血清陽性監(jiān)測指標中，至少有1項呈陽性反應(yīng)的89例，陽性表達率為20.65%(89/431)，聯(lián)合檢出率明顯高于任何單個指標檢出率，P<0.05。見表4。

表3 食管癌高發(fā)區(qū)431例無癥狀受檢人群性別與年齡分布 例(%)

表4 血清自身抗體表達對比食管內(nèi)鏡活檢病理結(jié)果 例(%)

2.3 高危人群推廣應(yīng)用結(jié)果在8 802例無癥狀人群中，1 584例至少有一項腫瘤相關(guān)抗原自身抗體表達陽性，占總?cè)藬?shù)的18.00%。對這1 584例抗體表達陽性的人群全部行色素內(nèi)鏡檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌前病變352例(4.00%，352/8 802)，食管癌210例(2.39%，210/8 802),早期食管癌198例，賁門癌2例(0.02%，2/8 802)，其余1 020例均正常。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)MDM2、GST和STAT3聯(lián)合檢測食管癌的敏感度達85%，特異性達70%，可以有效地發(fā)現(xiàn)早期食管癌。利用這3種抗體對省內(nèi)小范圍食管癌高發(fā)區(qū)的無癥狀人群行血清學自身抗體檢測，經(jīng)內(nèi)鏡和組織病理學檢查證實，顯著提高了食管癌的檢出率?？贵w表達陰性組342例人群中，食管癌僅1例。這一結(jié)果表明，利用血清自身抗體聯(lián)合檢測并結(jié)合內(nèi)鏡和黏膜活檢可能是食管癌早期發(fā)現(xiàn)的重要途徑。該方法可用于大規(guī)模無癥狀人群的篩查，優(yōu)勢是大大降低了檢查成本，受檢者痛苦小，容易被接受，臨床檢查周期短，技術(shù)含量要求低。然而，僅靠血清學檢測仍不能準確定位食管癌患者，自身抗體定性仍需結(jié)合內(nèi)鏡和黏膜活檢。在血清學檢測的基礎(chǔ)上，對高危人群行內(nèi)鏡和黏膜組織活檢可能是目前對食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群進行大范圍普查較好的方案。腫瘤的發(fā)展是一個多階段演進的過程，正常組織發(fā)生癌變后，不同腫瘤的病理類型間存在差異，同種病理類型之間有腫瘤的異質(zhì)性，所以，僅采用單一指標無法對腫瘤做出準確的診斷，聯(lián)合檢測多種相關(guān)自身抗體可顯著增加食管癌的檢出率。依據(jù)本實驗室之前的研究結(jié)果篩選這3種腫瘤相關(guān)自身抗體對食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群進行篩查。

MDM2在腦膜瘤、食管癌、胃癌等多種腫瘤中表達，與食管癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后關(guān)系密切[6]。趙仲生等研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌中有MDM2蛋白過表達，提示MDM2癌基因產(chǎn)物的過表達與食管癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[7]。李玉琴等闡明MDM2表達可引起胃上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化，抑制MDM2表達能促進胃癌細胞和胃上皮細胞凋亡，并抑制其侵襲，從而發(fā)揮抑制胃癌生長和胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的作用[8]。本實驗室研究也發(fā)現(xiàn)MDM2與食管癌相關(guān)[9]。

信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3，即STAT3的主要作用是參與信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，同時也對輔助性T細胞17(Th17)的分化起關(guān)鍵作用。武玉霞等研究發(fā)現(xiàn)STAT3蛋白表達影響正常妊娠[12]，許爽等研究表明STAT3在動脈粥樣硬化中起重要作用[13]，李福青等研究發(fā)現(xiàn)STAT3與結(jié)直腸腺癌密切相關(guān)[14]，王健等證明STAT3與食管癌病理特征相關(guān)[15]。

腫瘤細胞具有高速占位性增殖、浸潤與轉(zhuǎn)移等特點，基本可自我免疫耐受。腫瘤相關(guān)抗原在正常組織細胞中也可有微量合成，并不是腫瘤細胞特有，兩者僅有表達量的差異，因此稱為相關(guān)抗原，針對這些抗原，機體產(chǎn)生相應(yīng)的自身抗體。

從實驗室研究到用于高發(fā)區(qū)無癥狀高危人群，本研究的方法比過去沒有液體活檢更好，但仍然存在一定的局限性，假陽性、假陰性仍然不可避免，需要優(yōu)化組合更多的指標進一步探討，比如食管癌相關(guān)的基因、蛋白、自身抗體、miRNA、甲基化等。由于同一種腫瘤中可同時出現(xiàn)不同的腫瘤標志物，同一標志物也可在多種腫瘤中均有表達量的變化，所以聯(lián)合檢測多種血清腫瘤相關(guān)自身抗體將有助于提高早期食管癌的檢出率。自身抗體檢測聯(lián)合內(nèi)鏡黏膜活檢可能是食管癌早期發(fā)現(xiàn)的重要手段。