常晨陽，韓煥美，潘迎芬，單嬌，朱秀煥，劉偉

(1.聊城海關(guān) 山東聊城 252200；2.濟南 海關(guān)濟南 252000；3.東山海關(guān) 福建漳州 363401；4.黃島海關(guān) 山東青島 266500)

由于養(yǎng)殖戶在飼養(yǎng)過程中獸藥使用不規(guī)范或不科學(xué)等問題，雞蛋中獸藥殘超標(biāo)事件經(jīng)常被報出[1]，目前國標(biāo)對雞蛋中獸藥殘留的檢測方法是對不同種類獸藥分別檢測[2]，操作復(fù)雜、耗時費力。本研究以雞蛋日常風(fēng)險監(jiān)測中高風(fēng)險的喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類、抗病毒類、聚醚類抗生素、硝基咪唑類、抗球蟲藥類、大環(huán)內(nèi)酯類8 大類共31 種獸藥為檢測對象，優(yōu)化雞蛋中獸藥殘留的提取凈化方法，應(yīng)用全自動固相萃取SPE 代替?zhèn)鹘y(tǒng)的人工固相萃取操作，使得操作簡單省時[3]。聯(lián)用可實現(xiàn)高靈敏度、高通量檢測的高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀LC-MS/MS[4]，建立了雞蛋中多種獸藥殘留的同時檢測方法，為雞蛋樣品的藥殘風(fēng)險監(jiān)控提供新的技術(shù)手段，同時為蛋雞養(yǎng)殖業(yè)科學(xué)用藥提供技術(shù)參考。

1 試驗方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備

首先分別準(zhǔn)確稱量約10mg 固體標(biāo)準(zhǔn)品，于100mL 容量瓶中用乙腈定容，配制100μg/mL 濃度的單標(biāo)儲備液，然后根據(jù)待測的線性范圍配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)中間液，吸取一定量體積，用陰性雞蛋樣品基質(zhì)提取液制備混合標(biāo)準(zhǔn)濃度系列。

配制喹諾酮類（氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、達氟沙星、氟甲喹）的線性范圍為5～100μg/kg、磺胺類（磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺甲噁唑、磺胺喹噁啉、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺多辛）為10～200μg/kg、四環(huán)素類（土霉素、四環(huán)素、金霉素）10～200μg/kg、抗病毒類（金剛烷胺）1～100μg/kg、聚醚類抗生素（鹽霉素）10～200μg/kg、硝基咪唑類（洛硝噠唑、甲硝唑、異丙硝唑、二甲硝咪唑、羥基甲硝唑）0.5～100μg/kg、抗球蟲藥類（氯羥吡啶）5～100μg/kg、大環(huán)內(nèi)酯類（替米考星、竹桃霉素、紅霉素、交沙霉素）1～100μg/kg。

1.2 提取溶液的配制

提取溶劑為0.1mol/L 的Mcllvaine-Na2EDTA 緩沖液，配制方法為：稱取37.2g 乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA-2Na）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）10.9g、檸檬酸（C6H8O7·H2O）12.9g，用水溶解后稀釋于1,000mL 容量瓶中定容，之后用1mol/L NaOH 溶液調(diào)pH 至4.0。

1.3 樣品前處理

1.3.1 預(yù)處理取新鮮雞蛋樣品，去殼取可食部分在高速勻漿機中充分攪拌均勻，置于干凈容器中密封保存，4℃冰箱冷藏備用。

1.3.2 提取準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后的雞蛋樣品1.0g（精確到0.01g）于50mL 離心管中，加入10mL 1.2 的提取溶液，渦旋混勻后，超聲提取5min，10,000r/min 離心2min 后，轉(zhuǎn)移出上清液至新的離心管中，再吸取10mL 提取溶液按上述操作重復(fù)提取一次。合并兩次提取上清液，加入5mL 正己烷，渦旋1min 后，10,000r/min 離心2min，取下層清液經(jīng)固相萃取凈化。

1.3.3 凈化在全自動固相萃取儀工作站上設(shè)置洗脫程序，使用親水親脂共平衡聚合物基體反相InertSep HLB（200mg/6mL）固相萃取小柱凈化待測目標(biāo)物。程序設(shè)定見表1。

表1 全自動固相萃取儀設(shè)定洗脫程序

1.3.4 濃縮上機將1.3.3 中收集的洗脫液于38℃下氮吹至近干，用10%甲醇水（含0.1%甲酸）溶液定容至1mL，渦旋混勻后，過0.22μm PTFE 濾膜，經(jīng)高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

1.4 高效液相色譜條件

色譜柱：Shim-pack GISS C18（100×2.1mm，2μm）；流速：0.4mL/min；進樣量：5μL；柱溫：40℃；流動相：A 0.1%甲酸水，B 甲醇；梯度洗脫程序：0～1min,10%B；1～3min，10%B→50%B；3～6min，50%B→70%B；6～8min，70%B→90%B；8～11min，90%B；11～11.5min，90%B→10%B；11.5～13min，10%B。

1.5 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧離子源ESI，正離子模式；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM；接口溫度：300℃；DL 溫度：260℃；加熱模塊溫度：400℃；碰撞氣：高純氬氣（≥99.999%）；加熱氣：氮氣10L/min；霧化氣：高純氮氣3.0L/min；干燥氣：氮氣10L/min。各化合物的母離子、子離子、碰撞電壓參見國標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶液的選擇

提取溶液要考慮雞蛋基質(zhì)本身富含蛋白質(zhì)和脂肪的特點，同時兼顧待測31 種性質(zhì)存在差異的獸藥分子的回收效率。Mcllvaine-Na2EDTA 緩沖液中的檸檬酸鹽溶液在提取多種有機物分子的同時能夠很好的沉淀蛋白；其中的EDTA-Na2可以絡(luò)合溶液中金屬離子，顯著提高四環(huán)素類藥物的回收率；正己烷的脫脂操作，可進一步降低雞蛋中脂類干擾。

2.2 全自動固相萃取儀的優(yōu)勢

固相萃取是農(nóng)獸殘?zhí)崛≈凶畛Ｓ玫降膬艋绞絒5]，可顯著降低基質(zhì)效應(yīng)。但是操作步驟多、比較耗時。全自動固相萃取是近年來興起的一種自動化前處理設(shè)備，且全封閉式操作減少污染的風(fēng)險，使的操作更簡便、可靠。本實驗對比全手動過柱操作、帶空氣泵的半自動過柱和全自動固相萃取三種操作方式，統(tǒng)計人工操耗時、回收效率（以氧氟沙星數(shù)據(jù)為例），數(shù)據(jù)見表2，可見全自動固相萃取可減少手動工作，尤其在處理多個樣品時，可明顯提高工作效率，且因人為誤差減少，RSD 值更小，回收率穩(wěn)定重復(fù)性更好。

表2 手動、半自動、全自動固相萃取過柱方式比較

2.3 實驗方法學(xué)驗證

通過參考GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》，配制31 種獸藥的線性范圍，線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。1.1 中所配標(biāo)準(zhǔn)曲線的第一個點的信噪比（S/N）均大于10，符合最低定量限要求。通過陰性雞蛋樣品進行5μg/kg 和50.0μg/kg 兩個濃度水平加標(biāo)，按照1.2.1 經(jīng)前處理上機檢測，每組平行6 份樣品，考察回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。具體結(jié)果如下：5μg/kg 加標(biāo)濃度的加標(biāo)回收率69.5%～110.2%，RSD 為0.95%～10.4%；50μg/kg 加標(biāo)濃度的加標(biāo)回收率為72.4%～106.1%，RSD 為0.45%～11.8%，符合國標(biāo)GB/T 27417—2017《合格評定化學(xué)分析方法確認和驗證指南》中對回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求，滿足定性和定量檢測要求。

2.4 實際樣品測定

從超市、農(nóng)貿(mào)市場、養(yǎng)殖戶等不同渠道購買抽樣，累計對60 批次雞蛋中31 種獸藥進行高通量測定，二批次檢出陽性結(jié)果。一批次檢出氧氟沙星6.34μg/kg，一批次檢出磺胺間甲氧嘧啶20.1μg/kg，金剛烷胺17.6μg/kg。用國標(biāo)方法GB/T 20366—2006、GB/T 21316—2007、GB31660.5—2019 對樣品進行復(fù)檢，陽性檢出項目一致，數(shù)據(jù)見表3，檢出量偏差小于5%，進一步驗證了該方法的準(zhǔn)確性。

表3 實際樣品檢測結(jié)果與國標(biāo)方法對比（μg/kg）

3 結(jié)論與展望

在雞蛋中檢出的獸藥殘留有違規(guī)使用獸藥、不遵守休藥期規(guī)定等多方面原因。高通量檢測相對于單項目檢測，可大幅提高檢測速度，節(jié)約檢測資源和成本，是實現(xiàn)快速檢測需求的重要方式。

本方法結(jié)合雞蛋樣品的特點，將可實現(xiàn)凈化過程自動化操作的全自動固相萃取儀和高檢測靈敏度的液相色譜三重四級桿質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用，成功實現(xiàn)雞蛋中喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類、抗病毒類、聚醚類抗生素、硝基咪唑類、抗球蟲藥類、大環(huán)內(nèi)酯類、8 大類共31 種獸藥殘留的高通量同時檢測，該方法操作簡單、前處理自動化程度高，定量準(zhǔn)確，重復(fù)性好，既可滿足日常檢測需要，又為雞蛋藥殘風(fēng)險監(jiān)控、蛋雞養(yǎng)殖期安全用藥提供有力的技術(shù)支撐。