鄭鳳龍 任喜尚 楊潔

(鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系，河南 鄭州 450064)

急性心肌梗死(AMI)的青年患者數(shù)量逐年遞增，且男性患者比例較大〔1〕。AMI幸存患者1年后的發(fā)病率和死亡率仍高于普通人群〔2〕，而AMI的治療會(huì)引發(fā)心肌缺血再灌注損傷(MIRI)，如何避免和減輕MIRI是臨床亟需解決的問題，也是AMI臨床研究的熱點(diǎn)。研究表明，miRNA在心臟病和心力衰竭等過程中也存在調(diào)控作用，miRNA可能通過改變關(guān)鍵的信號(hào)分子，為MIRI提供潛在的治療靶點(diǎn)和心肌損傷標(biāo)志物〔3，4〕。MiR-24主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡，參與細(xì)胞分化及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔5〕。研究表明，心肌梗死后miR-24在心肌組織中表達(dá)降低，抑制梗死后心肌細(xì)胞的凋亡，改善心肌功能〔6〕。程序化細(xì)胞死亡因子(PDCD)5是一種促凋亡基因，在H2O2處理的心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)〔7〕。但兩者在心肌細(xì)胞中的作用機(jī)制尚不清楚。本課題以大鼠心肌細(xì)胞H9c2為研究對(duì)象，建立缺氧/復(fù)氧(H/R)模型，研究 miR-24-3p對(duì)H/R誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷、凋亡的分子機(jī)制，探討PDCD5在此機(jī)制中的作用，為MIRI的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠心肌細(xì)胞H9c2購(gòu)自ATCC；胎牛血清(FBS)和高糖/低糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胰蛋白酶Trypsin購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Total RNA提取試劑盒、 real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；抗PDCD5、抗Bcl-2、抗Bax和抗Cleaved-caspase-3抗體購(gòu)自Abcam公司；雙染色流式法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司，光學(xué)顯微鏡、全自動(dòng)酶標(biāo)儀及Real-time PCR儀購(gòu)自美國(guó)bio-rad公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 在含有10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，置于37℃、5% CO2恒溫密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，濕度95%。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，洗滌消化傳代。

1.3細(xì)胞H/R模型構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)分組 H/R模型建立：將低糖無血清DMEM培養(yǎng)基置于37℃ 低氧密閉培養(yǎng)箱中，以2 L/min的流速通入95%N2和5%CO2混合氣體，持續(xù)通入4 h充分飽和培養(yǎng)基，用上述培養(yǎng)基快速置換培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2高糖培養(yǎng)基，細(xì)胞于低氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，然后將培養(yǎng)液更換為10%FBS的高糖培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2恒溫密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h復(fù)氧。

實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組：37℃、5% CO2、95%空氣恒溫密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；H/R組：按照模型建立的方法進(jìn)行培養(yǎng)，缺氧3 h后復(fù)氧4 h；實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行H/R模型建立。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用培養(yǎng)液稀釋對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞融合為一層時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用無血清OptiMEM培養(yǎng)液稀釋Lipofectamine2000和各組載體后取脂質(zhì)體與等體積載體輕柔混勻，室溫孵育15 min，將混合液滴入培養(yǎng)好的細(xì)胞中，混合均勻，培養(yǎng)6 h后換成完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5Real-time PCR檢測(cè)RNA表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染48 h的各組H9c2細(xì)胞，用試劑盒提取總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，測(cè)定濃度和純度后置于-80℃保存。取cDNA按照 real-time PCR說明書進(jìn)行反應(yīng)，miR-24-3p上游引物為5′-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3′，下游引物為5′-ACCGAGUCAAGUCGUCCUUGUC-3′；PDCD5 上 游 引 物 為5′-CCATGGCGGACGAGGAGCTTG-3′，下 游 引 物 為5′-TCAATAATCGTCATCTTCATC-3′；反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 4 min，95℃ 30 s、60℃ 40 s、72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。運(yùn)用IQ5TM real-time PCR 檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率 收集處理好的各組H9c2細(xì)胞，接種于6孔板中(2×105個(gè)細(xì)胞/孔)，培養(yǎng)24 h，離心收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，稀釋細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，根據(jù)凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作，取100 μl標(biāo)記緩沖液重懸細(xì)胞，然后加入5 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC和10 μl碘化丙啶(PI)，室溫避光20 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.7雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的H9c2細(xì)胞進(jìn)行收集，Trypsin消化細(xì)胞后稀釋，以2×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板中，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，若細(xì)胞融合為一層時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，構(gòu)建PDCD5的野生型(WT-PDCD5)和突變型(MUT-PDCD5)雙熒光素酶報(bào)告載體，分別共轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-24-3p。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞室溫裂解20 min，離心收集上清，加入熒光素酶底物，檢測(cè)上清中熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計(jì)算相對(duì)螢火蟲熒光素酶活性。

1.8Western印跡檢測(cè)PDCD5和凋亡相關(guān)蛋白 收集培養(yǎng)好的H9c2細(xì)胞，加入裂解液孵育20 min，冰浴超聲破碎細(xì)胞，收集蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加入一抗(抗PDCD5抗體 1∶1 000，抗Bcl-2抗體1∶500，抗Bax抗體1∶1 000，抗Cleaved-caspase-3抗體1∶1 000)，4℃孵育過夜，PBST洗膜2次，加入稀釋的二抗(PDCD5二抗1∶1 500，Bcl-2二抗1∶100，Bax二抗1∶1 000，Cleaved-caspase-3二抗1∶1 000)室溫孵育2 h，分析蛋白水平，以GAPDH為內(nèi)參照。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1H/R處理對(duì)心肌細(xì)胞中miR-24-3p和PDCD5表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，H/R組心肌細(xì)胞中miR-24-3p表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，PDCD5 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，見圖1，表1。

圖1 PDCD5蛋白表達(dá)

表1 H/R處理對(duì)心肌細(xì)胞中miR-24-3p和PDCD5表達(dá)的影響

2.2miR-24-3p過表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞中LDH、SOD活性和MDA含量的影響 qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，H/R組miR-24-3p表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，與H/R+miR-NC組相比，H/R+miR-24-3p組miR-24-3p表達(dá)量顯著上升(P<0.05)。細(xì)胞損傷測(cè)定結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞中LDH和MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；與H/R+miR-NC組相比，H/R+miR-24-3p組LDH和MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)，見表2。

2.3miR-24-3p過表達(dá)可抑制心肌細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組相比，H/R組凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，Bax和Cleaved-caspase-3表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)；與H/R+miR-NC組相比，H/R+miR-24-3p組凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，Bax和Cleaved-caspase-3表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，見圖2，表3，圖3。

表2 miR-24-3p過表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞中LDH、SOD活性和MDA含量的影響

圖2 miR-24-3p過表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響

表3 miR-24-3p過表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響

圖3 各組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4抑制PDCD5表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞損傷的影響 與對(duì)照組相比，H/R組PDCD5蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，Bax表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)，細(xì)胞中LDH和MDA含量顯著增多(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；與H/R+si-NC組相比，H/R+si-PDCD5組PDCD5蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，Bax表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，細(xì)胞中LDH和MDA含量顯著減少(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)。見圖4，表4。

2.5miR-24-3p靶向調(diào)控PDCD5的表達(dá) Targetscan軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PDCD5的3′UTR序列中含有與miR-24-3p互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖5。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)所示，與miR-NC組(1.03±0.08、0.98±0.07)相比，miR-24-3p組WT-PDCD5螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性(0.42±0.03)顯著下降(t=17.488，P=0.000)；而MUT-PDCD5螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性(1.04±0.09)沒有明顯變化(t=1.289，P=0.226)。Western印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組(0.49±0.05)相比，miR-24-3p組PDCD5表達(dá)量(0.18±0.03)顯著下降(P<0.05)；與anti-miR-NC組(0.50±0.05)相比，anti-miR-24-3p組的PDCD5表達(dá)量(0.88±0.08)顯著上升(P<0.05)。見圖6。

表4 抑制PDCD5表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞損傷的影響

圖5 PDCD5的3′UTR中含有與miR-24-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

圖6 Western印跡檢測(cè)PDCD5蛋白表達(dá)

2.6PDCD5過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-24-3p對(duì)心肌細(xì)胞損傷的作用 與H/R+miR-NC組相比，H/R+miR-24-3p組PDCD5蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，細(xì)胞中LDH和MDA含量顯著減少(P<0.05)，SOD活性顯著上升(P<0.05)，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，Bax表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)；與H/R+miR-24-3p+pcDNA組相比，H/R+miR-24-3p+pcDNA-PDCD5組PDCD5蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，細(xì)胞中LDH和MDA含量顯著增多(P<0.05)，SOD活性顯著下降(P<0.05)，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，Bax表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)。見圖7，表5。

圖7 PDCD5和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 PDCD5過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-24-3p對(duì)心肌細(xì)胞損傷的作用

3 討 論

社會(huì)老年化的加劇和工作壓力的增大，AMI發(fā)病率越來越高，且呈年輕化趨勢(shì)，預(yù)計(jì)2030年AMI患者將接近2 300萬〔8〕。治療過程中產(chǎn)生的MIRI損傷可導(dǎo)致永久性殘疾或死亡，如何減輕AMI幸存者的MIRI損傷是臨床主要問題，目前尚無具體的靶向治療策略，研究MIRI的治療方式是這一領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)〔9〕。

miRNA如miR-1、miR-21、 miR-29、miR-92a、miR-101、 miR-499等通過調(diào)控心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等的增殖和凋亡，參與心臟發(fā)育、心肌重塑、心律失常和心力衰竭等生物過程〔10，11〕。研究發(fā)現(xiàn)，miR-24 參與心肌細(xì)胞的凋亡作用，益氣逐瘀方通過上調(diào)大鼠缺血心肌組織中的miR-24表達(dá)，減輕心肌梗死大鼠的心肌損傷和心肌細(xì)胞凋亡〔12〕。溫明華〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)的外泌體能夠通過傳遞miR-24至細(xì)胞中下調(diào)促凋亡蛋白Bim表達(dá)，從而減輕氧化應(yīng)激處理后H9c2細(xì)胞的凋亡。Xiao等〔14〕發(fā)現(xiàn)，miR-24-3p在缺血/再灌注(I/R)的心肌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-24-3p可通過激活Nrf2-Keap1途徑保護(hù)心肌細(xì)胞免受I/R損傷誘導(dǎo)的體外心肌細(xì)胞凋亡。Tan等〔15〕發(fā)現(xiàn)，在心肌I/R損傷小鼠模型中，miR-24-3p下調(diào)，miR-24-3p可通過抑制RIPK1，從而在心肌I/R損傷中發(fā)揮心臟保護(hù)作用。本研究也證實(shí)，miR-24-3p在H/R處理后的心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞中表達(dá)顯著下降，與Xiao等〔14〕和Tan等〔15〕研究結(jié)果一致，過表達(dá)miR-24-3p可減輕H/R對(duì)H9c2細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞抗氧化能力，抑制細(xì)胞凋亡，驗(yàn)證了miR-24-3p在H/R誘導(dǎo)的心肌損傷中發(fā)揮重要作用。

PDCD5原名TFAR19，最初是由我國(guó)學(xué)者從白血病細(xì)胞株TF-1中克隆得到，位于染色體19q12-q13.1，與P53、C-myc、Bcl-2和Bax等基因參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程〔16，17〕。而任安立等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，H/R損傷的H9c2細(xì)胞中，PDCD5表達(dá)水平升高，沉默PDCD5可抑制核因子(NF)-κB信號(hào)通路，進(jìn)而抑制H/R損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和自噬。周鳳華等〔19〕研究表明，I/R模型組大鼠心肌中PDCD5表達(dá)量顯著升高，中藥定心方可抑制PDCD5表達(dá)，激活ERK通路，減輕心肌損傷。Zhang等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠中，過表達(dá)PDCD5可誘導(dǎo)自噬和抑制凋亡進(jìn)而改善心臟功能和抑制由異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟重塑。本研究與任安立等〔18〕和周鳳華等〔19〕研究結(jié)果一致；抑制PDCD5表達(dá)可減輕H/R對(duì)H9c2細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞抗氧化能力，抑制細(xì)胞凋亡，驗(yàn)證了PDCD5在MIRI損傷中的作用。

此外，通過Targetscan軟件預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDCD5的3′UTR中含有與miR-24-3p互補(bǔ)的核苷酸序列，預(yù)示miR-24-3p與PDCD5可能存在結(jié)合位點(diǎn)或某種調(diào)控關(guān)系。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果也顯示，miR-24-3p靶向負(fù)調(diào)控PDCD5的表達(dá)，過表達(dá)PDCD5可逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-24-3p對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的作用，即miR-24-3p通過下調(diào)PDCD5表達(dá)減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2損傷，抑制細(xì)胞凋亡，驗(yàn)證了兩者在心肌細(xì)胞中存在調(diào)控關(guān)系。

本研究首次發(fā)現(xiàn)，在H/R處理的大鼠心肌細(xì)胞H9c2中，miR-24-3p通過靶向抑制PDCD5表達(dá)進(jìn)而減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡。另外，上調(diào)miR-24-3p可能通過抑制RIPK1和PDCD5，激活Nrf2-Keap1和ERK通路，抑制NF-κB信號(hào)通路，達(dá)到減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用。

綜上，miR-24-3p有望成為心肌細(xì)胞MIRI損傷分子治療的新靶點(diǎn)，對(duì)患者M(jìn)IRI損傷治療和提高患者生存質(zhì)量具有重要指導(dǎo)意義。