劉宏 仲麗麗 于穎 張雨薇 楊婧 代巧妹 李冀

(1黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

阿爾茨海默病(AD)是一種不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)退行性疾病〔1〕，在中醫(yī)屬于“癡呆”范疇，多發(fā)生于老年人，由氣虛和腎虛所致，結(jié)合“腎腦相通”中醫(yī)理論，補(bǔ)腎治療AD存在一定的合理性〔2〕。左歸丸是傳統(tǒng)補(bǔ)腎陰藥物〔3〕。據(jù)報(bào)道，左歸丸可通過促進(jìn)熱休克蛋白的表達(dá)，抑制AD模型神經(jīng)細(xì)胞的凋亡〔4〕，并且對 AD 大鼠海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞使抗氧化能力增強(qiáng)〔5，6〕。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)左歸丸可以改善腦缺血大鼠的記憶力〔7〕及提高大鼠腦內(nèi)雌激素受體(ER)的表達(dá)，并且運(yùn)用ER拮抗劑之后，左歸丸的這種神經(jīng)保護(hù)作用大部分消失〔8〕。因此，考慮左歸丸對神經(jīng)元的保護(hù)作用可能與下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)存在聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)在穩(wěn)定的AD細(xì)胞模型上，探討左歸丸對細(xì)胞存活的影響及對ER表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 Aβ1～42小鼠單克隆抗體(吉爾生化)，左歸丸，購自北京同仁堂藥店。ER單克隆抗體(wanleibio)、活化的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-Caspase)3單克隆抗體(wanleibio)、羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HRP)(wanleibio)內(nèi)參抗體 β-actin(wanleibio)、電化學(xué)發(fā)光(ECL)液(wanleibio)、大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞(PC12)(procell)。

1.2主要儀器 酶標(biāo)儀(BIOTEK)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特)、凝膠成像系統(tǒng)(北京六一)超純水系統(tǒng)(Heal Force 公司)、超速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀)、CO2培養(yǎng)箱(上海力申)、超凈工作臺(蘇州凈化)、RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)。

1.3藥物配制 將5 mg Aβ1～42溶于28.3 μl的二甲基亞砜(DMSO)中，配成濃度為40 μmol/L的儲(chǔ)存液，用超純水稀釋，分裝保存。取100 μl的Aβ1～42置于37℃培養(yǎng)箱7 d，進(jìn)行老化處理。

1.4分組 對照組、模型組、Aβ1～42+低濃度含藥血清組(干預(yù)組1)、Aβ1～42+中濃度含藥血清組(干預(yù)組2)、Aβ1～42+高濃度含藥血清組(干預(yù)組3)。

1.5給藥 正常培養(yǎng)PC12細(xì)胞，給予Aβ1～42(40 μmol/L)處理作為模型組，藥物干預(yù)組分別給予低(3%)、中(5%)、高濃度(10%)的含藥血清。

1.6MTT法檢測細(xì)胞活力 分別將24 h、48 h、72 h細(xì)胞加入MTT染色液，酶標(biāo)儀測定OD值。

1.7Western印跡法 檢測含藥血清干預(yù)前后細(xì)胞中雌激素受體(ER)、Cleaved-Caspase3蛋白的表達(dá)。Cleaved-Caspase3(1∶500稀釋)4℃孵育12 h，目的分子量20 kD，ER1(1∶500稀釋)，4℃12 h，目的分子量66 kD。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1MTT檢測結(jié)果 與對照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.05)，與模型組比較，干預(yù)組1細(xì)胞存活率顯著增加(P<0.05)；與干預(yù)組1比較，干預(yù)組2細(xì)胞存活率顯著增加(P<0.05)；與干預(yù)組2比較，干預(yù)組3細(xì)胞存活率顯著增加(P<0.05)。見表1。

2.2Cleaved-Caspase3表達(dá)情況 與對照組比較，模型組Cleaved-Caspase3表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)組1 Cleaved-Caspase3表達(dá)顯著下降(P<0.05)；與干預(yù)組1比較，干預(yù)組2 Cleaved-Caspase3表達(dá)顯著下降(P<0.05)；與干預(yù)組2比較，干預(yù)組3 Cleaved-Caspase3表達(dá)顯著下降(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 各組細(xì)胞活力及Cleaved-Caspase3、ER1蛋白表達(dá)比較

2.3ER1表達(dá)情況 與對照組比較，模型組ER1表達(dá)顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)組1 ER1表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與干預(yù)組1比較，干預(yù)組2 ER1表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與干預(yù)組2比較，干預(yù)組3 ER1表達(dá)顯著增加(P<0.05)，見表1、圖1。

圖1 Western印跡檢測各組細(xì)胞Cleaved-Caspase3、ER1表達(dá)

3 討 論

AD臨床治療常以補(bǔ)腎化痰、補(bǔ)腎開竅、補(bǔ)腎活血為常見的配方組合〔9，10〕，其中，補(bǔ)腎是關(guān)鍵。中醫(yī)藏象學(xué)認(rèn)為“腎主骨生髓通于腦”〔11〕，腎氣充盈，頭腦靈活，腎氣虧虛，健忘智衰。本課題組從中醫(yī)傳統(tǒng)理論出發(fā)，認(rèn)為老年癡呆的主要病機(jī)是腎氣的缺損。腎虛導(dǎo)致腦無所養(yǎng)，腦衰健忘。故治療當(dāng)用補(bǔ)腎法〔12〕。有報(bào)道指出，左歸丸對衰老小鼠AD模型有保護(hù)作用，通過抑制自由基生成保護(hù)神經(jīng)元免受氧化損傷，防治AD〔13，14〕。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，AD患者行穴位電針療法配合加味左歸丸治療后，療效確切，能顯著提高患者的認(rèn)知功能，提升其生活自理能力和生活質(zhì)量〔15〕。王恩龍〔16〕用加味左歸丸治療老年性癡呆(AD)患者20例，取得一定療效，并與用多奈哌齊片治療的20例進(jìn)行對照，結(jié)果顯示二者療效無顯著差別。左歸丸具有滋陰補(bǔ)腎、填精益髓之效，切合 AD 腎精不足、腦髓失養(yǎng)、 神機(jī)失用的關(guān)鍵病機(jī)。陰虛乃衰老之本，據(jù)報(bào)道左歸丸治療老年癡呆等老年性疾病，收效顯著〔17，18〕。本研究AD細(xì)胞模型〔19〕的基礎(chǔ)上，應(yīng)用左歸丸含藥血清干預(yù)AD細(xì)胞。結(jié)果顯示，與模型組較，左歸丸含藥血清對Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷有抑制作用，這與田旭升等〔20〕的研究一致。

細(xì)胞凋亡和自噬參與神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)對各種刺激的反應(yīng)，細(xì)胞凋亡過多或自噬缺陷均與神經(jīng)退行性變有關(guān)〔21〕。這兩個(gè)過程可能協(xié)同或拮抗作用，類固醇激素受體是細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)節(jié)因子，但它們在各種病理過程中的作用是復(fù)雜的。一般來說，雌激素、孕酮和礦物皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)抗凋亡信號，而雄激素和糖皮質(zhì)激素受體(GR)參與促凋亡途徑〔22〕。研究表明，雌激素通過誘導(dǎo)海馬和皮層神經(jīng)元信號通路聚集在線粒體上，通過維持鈣穩(wěn)態(tài)、強(qiáng)化有氧糖酵解、持續(xù)和增強(qiáng)線粒體功能，促進(jìn)有效的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和β淀粉樣清除，對AD具有一定的治療意義〔23〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，左歸丸有可能通過上調(diào)ER的表達(dá)抑制AD細(xì)胞的凋亡。

綜上，ER有可能是中醫(yī)學(xué)“腎腦相關(guān)”的通路之一。中醫(yī)學(xué)“腎通于腦”理論在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中可能與多種分子機(jī)制有關(guān)，還需進(jìn)一步探索。