孫得勝，劉虹延，劉先勝，歐陽(yáng)瑤，徐永健

肺動(dòng)脈高壓是臨床上比較常見(jiàn)、但是未受到重視的一類(lèi)肺血管疾病，其特征是各種原因?qū)е路窝茏枇Ξ惓Ｔ黾?，進(jìn)而發(fā)生持續(xù)和顯著的肺動(dòng)脈壓力升高、右心室功能障礙，最終導(dǎo)致失代償性心力衰竭，甚至死亡［1-2］。作為一種常危及生命的疾病，肺動(dòng)脈高壓可以作為一類(lèi)獨(dú)立的疾病，也可以作為多種常見(jiàn)疾病〔如慢性阻塞性肺疾?。ê?jiǎn)稱(chēng)慢阻肺）、慢性血栓栓塞、結(jié)締組織疾病等〕發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，以及增加上述疾病發(fā)病率和降低患者生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量及預(yù)后。近年來(lái)，雖然在肺動(dòng)脈高壓基因和分子生物學(xué)方面的研究取得較大進(jìn)展，但目前高發(fā)病率、高死亡率的現(xiàn)狀并無(wú)明顯改善。因此，積極探索其病理機(jī)制，進(jìn)一步尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)具有重要臨床意義。

一項(xiàng)慢阻肺合并肺動(dòng)脈高壓的小鼠模型實(shí)驗(yàn)顯示，模型組小鼠的肺血管重塑與其肺小血管的肌化有關(guān)，隨著肺小血管肌化程度加重，模型組小鼠肺血管重塑程度加重，其血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)也隨之改變［3］。

以往認(rèn)為，慢阻肺患者或者長(zhǎng)期吸煙患者發(fā)生肺動(dòng)脈高壓是因?yàn)榛颊呋疾∵^(guò)程中發(fā)生了缺氧，因?yàn)槁匀毖醮碳ざ鸱窝苁湛s、紅細(xì)胞增多進(jìn)而導(dǎo)致血液黏稠、肺小動(dòng)脈重構(gòu)，從而引發(fā)肺動(dòng)脈高壓，因此部分學(xué)者認(rèn)為此情況下肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生是繼發(fā)或伴發(fā)于慢阻肺［4］。但是有研究發(fā)現(xiàn)，部分慢阻肺患者中的吸煙人群在疾病的早期、甚至在肺功能正常且未發(fā)生明顯缺氧表現(xiàn)時(shí)已發(fā)生肺小血管重塑，香煙煙霧可直接作用于肺血管系統(tǒng)，導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓［5-7］，但是具體機(jī)制尚不清楚，在這種單純的香煙煙霧的作用下是否伴有肺小血管肌化尚待研究。

本實(shí)驗(yàn)擬研究在單純香煙煙霧刺激的情況下，能否有效構(gòu)建肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型，從而為研究肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制構(gòu)建平臺(tái)，同時(shí)觀察在肺動(dòng)脈重塑的發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中，肺小血管肌化在其中扮演的角色，為進(jìn)一步深入探討香煙煙霧在這一發(fā)病過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 2018年1—5月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選取清潔級(jí)雄性SD大鼠16只，體質(zhì)量200 g左右，購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔SCXK（鄂）2015-0018〕。香煙煙霧暴露動(dòng)物染毒系統(tǒng)（本課題組自主研發(fā)，專(zhuān)利號(hào)ZL201820234399.3），Olympus光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯有限公司），通用型免疫組化試劑盒（上?；蚩萍脊荆?，小鼠抗大鼠α-SMA單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），香煙（紅金龍牌，煙氣煙堿量0.6 mg、焦油含量9 mg、煙氣一氧化碳量11 mg，湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司）。

1.2 造模方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組和模型組，各8只。模型組大鼠在自制煙霧染毒箱［8］內(nèi)接受香煙煙霧暴露，2次/d，燃香煙12支/次，連續(xù)造模4個(gè)月，箱內(nèi)氧濃度波動(dòng)于18%～21%，造模時(shí)箱內(nèi)一氧化碳濃度為900 mg/L。對(duì)照組不予香煙煙霧刺激。模型組右心室收縮壓和平均右心室壓高于對(duì)照組可判定造模成功。

1.3 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 造模滿(mǎn)4個(gè)月時(shí)，觀察大鼠活動(dòng)、飲食、毛發(fā)等一般狀況并檢測(cè)右心室收縮壓和平均右心室壓。兩組大鼠逐只稱(chēng)重量后，以2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，迅速進(jìn)行氣管插管、連接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助通氣，并調(diào)節(jié)合適的吸呼比、潮氣量等。參考國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)的經(jīng)驗(yàn)［9-12］，予右心導(dǎo)管法檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)，具體如下：切開(kāi)大鼠的頸部皮膚，分離大鼠頸靜脈，結(jié)扎靜脈遠(yuǎn)端，在靜脈的近心端剪一楔形口，隨之順勢(shì)將內(nèi)置有導(dǎo)絲的測(cè)量管插入，并輕輕地向前推進(jìn)，后經(jīng)鎖骨下靜脈進(jìn)入右心房，然后緩慢進(jìn)入右心室，此時(shí)可見(jiàn)導(dǎo)管內(nèi)有血液回流，立即退出導(dǎo)絲，將導(dǎo)管末端連接探測(cè)儀，觀察波形并調(diào)整導(dǎo)管方向，待波形典型并穩(wěn)定后記錄，最后以PowerLab 軟件分析右心室收縮壓和平均右心室壓。

1.4 評(píng)估右心室肥厚程度 檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)后，取大鼠的肺葉組織予以4%多聚甲醛固定。剪破大鼠的右心耳，將心室里的血液用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈。剝離右心室室壁，心臟分離為右心室、左心室+室間隔兩部分，將各組織在干凈濾紙上濾去多余的水分，然后分別稱(chēng)量。計(jì)算右心室肥厚指數(shù)、右心室重量和體質(zhì)量的比值（RV/BW）。

1.5 肺血管肌化程度 將固定好的大鼠肺組織用石蠟包埋并制作切片，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺小血管中α-SMA的表達(dá)，以評(píng)估肺血管肌化程度。α-SMA陽(yáng)性表達(dá)長(zhǎng)度＜血管周長(zhǎng)的25%，記作未肌化；陽(yáng)性表達(dá)長(zhǎng)度＞血管總周長(zhǎng)的75%，記作完全肌化；介于兩者之間的記為部分肌化。測(cè)量、計(jì)算兩組大鼠肺小血管總的肌化水平并分類(lèi)計(jì)算兩組大鼠肺小血管完全肌化、部分肌化以及未肌化比例，并比較兩組間的差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以（x± s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠的一般情況 造模4個(gè)月后，對(duì)照組大鼠活動(dòng)、飲食、毛發(fā)等一般狀況未見(jiàn)異常，而模型組大鼠明顯表現(xiàn)出倦怠狀態(tài)，常蜷縮于角落，不積極尋覓食物，毛發(fā)也變得比較枯黃。模型組大鼠右心室收縮壓和平均右心室壓高于對(duì)照組，體質(zhì)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表1）。

2.2 兩組大鼠右心室肥厚程度比較 模型組右心室肥厚指數(shù)和RV/BW高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表 2）。

2.3 兩組大鼠肺小血管肌化比例比較 肺動(dòng)脈高壓模型組大鼠的肺血管中α-SMA的表達(dá)水平強(qiáng)于對(duì)照組（見(jiàn)圖1）。對(duì)照組大鼠的肺小血管肌化比例低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組肺小血管中未肌化比例低于對(duì)照組，部分肌化和完全肌化比例高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表3）。

3 討論

吸煙早已成為當(dāng)今社會(huì)中一個(gè)嚴(yán)重影響健康的問(wèn)題。大量科學(xué)證據(jù)表明，吸煙可導(dǎo)致多部位惡性腫瘤、多種慢性疾病、生殖與發(fā)育異常，還與其他很多疾病及健康問(wèn)題的發(fā)生密切相關(guān)［13-15］。對(duì)于吸煙對(duì)健康影響的研究，目前常通過(guò)建立整體動(dòng)物煙霧染毒模型來(lái)完成，如何成功建立模擬人類(lèi)吸煙的動(dòng)物模型是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，建立一種將香煙煙霧給實(shí)驗(yàn)對(duì)象染毒的裝置是非常必要的，本課題組自主研發(fā)了香煙煙霧暴露動(dòng)物染毒系統(tǒng)（專(zhuān)利號(hào)：ZL201820234399.3），為本研究的順利開(kāi)展創(chuàng)造了有利條件。在科學(xué)研究的過(guò)程中，研究某一種致病因素對(duì)某一疾病的影響，需要盡可能地排除或避免其他容易導(dǎo)致該病的常見(jiàn)危險(xiǎn)因素的混淆和干擾。市面上常見(jiàn)的小動(dòng)物熏煙箱一般無(wú)法監(jiān)測(cè)箱內(nèi)的氧氣濃度和煙霧濃度，而本課題組研制的動(dòng)物染毒系統(tǒng)在設(shè)計(jì)上兼顧了上述因素，一方面通過(guò)設(shè)置和調(diào)節(jié)恒定的煙霧濃度保障了造模條件的穩(wěn)定性，另一方面通過(guò)氧濃度的監(jiān)測(cè)避免了環(huán)境缺氧對(duì)研究結(jié)果的干擾。

表1 兩組右心室壓力和體質(zhì)量比較（±s）Table 1 Comparison of the mean right ventricular pressure and body weight of two groups of rats at the completion of modeling

表1 兩組右心室壓力和體質(zhì)量比較（±s）Table 1 Comparison of the mean right ventricular pressure and body weight of two groups of rats at the completion of modeling

體質(zhì)量（g）對(duì)照組 8 2 1±4 1 3±2 4 9 3.8±1 5.0模型組 8 4 2±8 2 3±5 4 0 1.3±4.9 t值 6.9 9 5.3 7 5.8 7 P值 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1組別 只數(shù) 右心室收縮壓（m m H g）平均右心室壓（m m H g）

表2 兩組大鼠右心室肥厚程度比較（±s）Table 2 Comparison of right ventricular hypertrophy between two groups of rats

表2 兩組大鼠右心室肥厚程度比較（±s）Table 2 Comparison of right ventricular hypertrophy between two groups of rats

注：RV/BW=右心室質(zhì)量和體質(zhì)量的比值

組別 只數(shù) 右心室肥厚指數(shù) RV/BW對(duì)照組 8 0.21±0.01 0.39±0.08模型組 8 0.34±0.03 0.64±0.10 t值 10.96 5.13 P值 ＜0.001 ＜0.001

圖1 大鼠小血管肌化水平（免疫組化，×100倍）Figure 1 Level of muscularization of pulmonary arterioles in rats of control group versus those of the model group

表3 對(duì)照組和吸煙組大鼠小血管肌化水平的比較（±s，%）Table 3 Comparison of the level of muscularization of pulmonary arterioles between two groups of rats

表3 對(duì)照組和吸煙組大鼠小血管肌化水平的比較（±s，%）Table 3 Comparison of the level of muscularization of pulmonary arterioles between two groups of rats

完全肌化比例對(duì)照組 8 2 1.3 3±4.0 4 8 2.0 0±2.1 6 1 0.6 7±2.0 4 1 0.6 7±1.9 7模型組 8 4 1.3 3±1.5 3 5 4.0 0±3.0 4 1 7.0 0±2.2 5 2 5.6 7±3.3 8 t值 8.0 2 8.7 6 1.9 8 4.6 9 P值 ＜0.0 1 ＜0.0 1 ＜0.0 5 ＜0.0 1組別 只數(shù) 總肌化比例 未肌化比例 部分肌化比例

香煙煙霧能否作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素直接引起肺動(dòng)脈高壓，仍存在爭(zhēng)議，甚至世界衛(wèi)生組織的肺動(dòng)脈高壓會(huì)議給出的肺動(dòng)脈高壓分類(lèi)說(shuō)明也沒(méi)有確認(rèn)吸煙是肺動(dòng)脈高壓的致病因素［16］。但是，部分吸煙的肺動(dòng)脈高壓患者并沒(méi)有伴發(fā)慢阻肺。而關(guān)于香煙煙霧引起的慢阻肺的研究發(fā)現(xiàn)，肺循環(huán)的改變發(fā)生在該疾病的初期，而缺氧在該疾病的早期并不存在，從而表明香煙煙霧刺激可能直接引起肺動(dòng)脈高壓［5，17］。因而，探討單純的香煙煙霧的造模刺激是否能誘導(dǎo)出肺動(dòng)脈高壓的疾病模型、并進(jìn)一步探究其機(jī)制，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠右心室收縮壓和平均右心室壓高于對(duì)照組。眾所周知，右心室收縮壓和平均右心室壓在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中常用來(lái)代表受試動(dòng)物的肺動(dòng)脈收縮壓及平均肺動(dòng)脈壓，所以上述結(jié)果提示本研究肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型構(gòu)建成功。

因?yàn)槿毖跏且鸱蝿?dòng)脈高壓的常見(jiàn)危險(xiǎn)因素，本研究為了排除環(huán)境缺氧對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)了造模期間香煙煙霧暴露動(dòng)物染毒系統(tǒng)中氧氣的濃度。另外，本課題組前期研究采集各組大鼠的腹主動(dòng)脈動(dòng)脈血1 ml行動(dòng)脈血?dú)夥治?，各組間大鼠的動(dòng)脈血氧分壓無(wú)差異（P＞0.05）［18］，從而確保本研究造模過(guò)程中肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生是在單純的香煙煙霧的刺激下形成的，進(jìn)一步避免了缺氧因素在本研究中的混雜作用。

右心室肥厚指數(shù)和RV/BW是常用的檢測(cè)右心室肥厚程度的指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示，模型組右心室肥厚指數(shù)和RV/BW高于對(duì)照組，提示隨著患鼠肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生、發(fā)展，其右心室肥厚程度比對(duì)照組明顯加重，這也符合臨床上肺動(dòng)脈高壓患者的右心室病理改變的特點(diǎn)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的肺小血管中α-SMA的表達(dá)水平強(qiáng)于對(duì)照組，提示在香煙煙霧的長(zhǎng)期刺激下，大鼠的肺小血管的肌化程度明顯加重，本研究結(jié)果與國(guó)外的一項(xiàng)關(guān)于慢阻肺合并肺動(dòng)脈高壓的小鼠模型研究得到的結(jié)論一致［3］。對(duì)照組大鼠的肺小血管肌化比例低于模型組，模型組肺小血管中未肌化比例低于對(duì)照組，部分肌化和完全肌化比例高于對(duì)照組，結(jié)果顯示肺動(dòng)脈高壓模型組的未肌化肺小血管明顯減少，而完全肌化了的肺小血管和部分肌化了的肺小血管的比例明顯升高。

肺小血管的肌化改變是肺血管重塑比較常見(jiàn)的表現(xiàn)形式，而肺血管重塑是肺動(dòng)脈高壓發(fā)病環(huán)節(jié)中除了肺血管收縮以外最重要的病理特征之一，被認(rèn)為是肺動(dòng)脈高壓發(fā)生、發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，在香煙煙霧刺激誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠模型中，單純香煙煙霧刺激可直接導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生，香煙煙霧可作為肺動(dòng)脈高壓致病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，肺動(dòng)脈高壓患鼠的肺小血管的肌化程度，比健康對(duì)照組明顯加重，提示著其發(fā)病可能與肺小血管的肌化程度加重有關(guān)。

綜上所述，單純香煙煙霧刺激可直接誘發(fā)肺動(dòng)脈高壓，其發(fā)病機(jī)制可能與肺小動(dòng)脈都的肌化程度加重有關(guān)。

作者貢獻(xiàn)：孫得勝進(jìn)行研究設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫(xiě)論文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；劉虹延、劉先勝、歐陽(yáng)瑤進(jìn)行研究實(shí)施、評(píng)估、資料收集；孫得勝、徐永健進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。