范利超，顏鵬，韓文炎

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所， 浙江 杭州 310008)

土壤原位酶譜技術(shù)(soil zymography)是一種新興的二維空間土壤酶活性可視化及定量化的技術(shù)，由于其無破壞且可重復(fù)測(cè)量的特征，近年來在農(nóng)業(yè)和生態(tài)學(xué)領(lǐng)域得到了快速發(fā)展[1]。土壤原位酶譜技術(shù)是底物誘導(dǎo)型酶活性(substrate-dependent enzyme activity)的可視化技術(shù)，其原理是利用土壤中的活性酶氧化分解由熒光染料與相應(yīng)底物合成的特定熒光底物，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)在尼龍膜上顯影的過程[2]。合成的熒光底物最初位于膜上，被熒光底物浸泡飽和的尼龍膜與土壤表面緊密貼合后，合成的熒光底物在遇到土壤表面的特定酶時(shí)被分解，從而激活熒光[2]。土壤原位酶譜技術(shù)的結(jié)果是由在紫外燈下顯影并利用相機(jī)通過合適的設(shè)備設(shè)定后拍攝的二維圖像，被稱為原位酶譜(zymogram)[2]。原位酶譜圖像可以進(jìn)一步定量為單位面積和單位時(shí)間的酶活性。Baldrian等[3]第一次嘗試進(jìn)行了土壤酶活性的可視化，即將合成的熒光標(biāo)記底物溶解在瓊脂糖溶液中，然后把溶液直接倒灑在土壤樣品表面而不是利用膜作為載體。Spohn等[1]第一次采用尼龍膜作為合成熒光標(biāo)記底物的載體，應(yīng)用于土壤表面實(shí)現(xiàn)了土壤酶活性的二維顯影。用于土壤酶譜的熒光染料底物有多種[2]，例如7-氨基-4-甲基香豆素(7-amino-4-methyl coumarin，AMC)和4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone，MUF)等。目前，土壤酶譜可視化的酶共有十種[2]，分別為α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)、β-纖維二糖苷酶(β-cellobiosidase)、木聚糖酶(xylanase)、磷酸酶(phosphatase)、亮氨酸氨基肽酶(leucine-aminopeptidase)、酪氨酸氨基肽酶(tyrosine-aminopeptidase)、幾丁質(zhì)酶(chitinase)、殼三糖苷酶(chitotriosidase)和過氧化物酶(peroxidase)。

土壤原位酶譜技術(shù)被發(fā)展應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和生態(tài)學(xué)的多個(gè)方面[4-5]：(1)在田間和實(shí)驗(yàn)室條件下比較不同植物類型之間的酶活性分布特征。例如，Razavi等[6]比較了在氣候室根箱(rhizobox)種植條件下玉米(Zeamays)和扁豆(Lensculinaris)的土壤酶活性的空間分布，其結(jié)果表明扁豆根部的酶活性是均勻分布的，而玉米根尖處酶活性較高，從根尖向外酶活性逐漸降低直到相對(duì)穩(wěn)定(圖1)。(2)環(huán)境因素對(duì)土壤酶活性的影響，例如溫度[7]、水分[8-9]、營(yíng)養(yǎng)元素[10]和重金屬污染[11]等。(3)根形態(tài)對(duì)土壤酶活性的影響，例如根毛及根徑大小[12-13]。(4)土壤酶活性在不同土壤層面的差異，例如植物根際(rhizosphere)[14-15]、土壤生物孔洞(biopores)[16]和植物殘?bào)w形成的土孔環(huán)境(detritusphere)[17-18]。(5)鑒定植物根際范圍大小和土壤微生物活動(dòng)的“熱點(diǎn)”區(qū)域[4,19]。但是，土壤原位酶譜技術(shù)反映的是土壤剖面或根箱表層土壤的酶活性而不是代表整個(gè)土體，因此，土壤原位酶譜技術(shù)并不能取代經(jīng)典的酶活性測(cè)定方法[3]。

A和B分別為扁豆和玉米根箱土壤表層的酶譜，其中每個(gè)圖中a～d分別為亮氨酸氨基肽酶、磷酸酶、β-葡萄糖苷酶及纖維二糖苷酶。C和D分別為扁豆和玉米植株根尖區(qū)域的酶活性變化特征，詳情分析可見參考文獻(xiàn)[6]。圖片使用已獲參考文獻(xiàn)[6]的作者授權(quán)。圖1 土壤原位酶譜的實(shí)例

文獻(xiàn)計(jì)量分析是一種基于數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)的定量分析方法，該方法使用文獻(xiàn)來客觀有效地評(píng)估學(xué)科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和研究趨勢(shì)[20-21]。當(dāng)前，許多學(xué)者已經(jīng)使用這種方法探索了農(nóng)業(yè)、經(jīng)濟(jì)、政治、 生態(tài)、管理等諸多學(xué)科研究的前沿和熱點(diǎn)[22-23]。為此，本研究擬基于Web of Science收錄數(shù)據(jù)，對(duì)當(dāng)前土壤原位酶譜技術(shù)研究進(jìn)行文獻(xiàn)計(jì)量分析，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 數(shù)據(jù)來源與研究方法

本文用于文獻(xiàn)計(jì)量分析的數(shù)據(jù)來源于科睿唯安的 Web of Science核心合集數(shù)據(jù)庫(kù)(Core Collection)。以soil-zymography為文獻(xiàn)檢索的主題詞(TS)，則可以檢索出以學(xué)術(shù)術(shù)語“soil-zymography”為主題但排除其他zymography相關(guān)的論文。對(duì)所有年份 (All years) 和文獻(xiàn)類型為Article和Review的文獻(xiàn)進(jìn)行檢索。本文文獻(xiàn)數(shù)據(jù)集的檢索時(shí)間為2020年4月18日。利用Web of Science 自帶的分析工具、VOSviewer[24]和HistCite軟件對(duì)土壤原位酶譜研究領(lǐng)域的發(fā)文數(shù)量和被引次數(shù)的變化趨勢(shì)、主要發(fā)文國(guó)家和機(jī)構(gòu)以及作者之間的合作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系、研究領(lǐng)域的學(xué)科分布、關(guān)鍵詞及研究熱點(diǎn)等進(jìn)行分析。其中合并同義的關(guān)鍵詞，例如soil zymography與zymography，enzyme activity與enzyme activities等。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)文數(shù)量和被引次數(shù)

發(fā)文數(shù)量可反映該領(lǐng)域的發(fā)展速度和發(fā)展進(jìn)程，可表征研究者對(duì)本領(lǐng)域的關(guān)注程度[22]。通過檢索，得到的土壤原位酶譜領(lǐng)域的文獻(xiàn)數(shù)量為29篇(圖2)。總文獻(xiàn)數(shù)量較低說明土壤原位酶譜技術(shù)仍然處于發(fā)展的前期階段。第一篇以“soil-zymography”為特定主題的文獻(xiàn)出現(xiàn)在2013年，從2013年至2018年，年發(fā)文數(shù)量相對(duì)平穩(wěn)。2019年發(fā)文量為10篇，占總文獻(xiàn)集的34%。文獻(xiàn)被引次數(shù)逐年增加，總被引次數(shù)為572次，其中2019年的被引次數(shù)為222次，占總被引次數(shù)的39%。Spohn等[1]在2013年首次以“soil zymography”為題發(fā)文在SoilBiology&Biochemistry上，目前該篇論文的被引次數(shù)為50次。單篇文獻(xiàn)最高被引次數(shù)為85次，是Spohn等[14]于2013年發(fā)表在SoilBiology&Biochemistry上的另一篇論文。這些數(shù)據(jù)說明土壤原位酶譜技術(shù)經(jīng)過幾年的發(fā)展和不斷完善，即將迎來快速發(fā)展的時(shí)期。

圖2 土壤原位酶譜技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)的發(fā)文數(shù)量和被引次數(shù)

2.2 論文來源國(guó)家/地區(qū)和研究機(jī)構(gòu)

通過檢索，土壤原位酶譜技術(shù)相關(guān)論文的來源國(guó)家/地區(qū)共14個(gè)。從表1可以看出，德國(guó)的發(fā)文或參與發(fā)文數(shù)量和總被引次數(shù)高居首位，分別為24篇和436次。因?yàn)榭偘l(fā)文數(shù)量為29篇，而德國(guó)發(fā)文量或參與發(fā)文量占83%，說明德國(guó)是土壤原位酶譜技術(shù)研究的主要參與國(guó)家。參與土壤原位酶譜技術(shù)研究領(lǐng)域的機(jī)構(gòu)超過了40個(gè)，其中德國(guó)哥廷根大學(xué)參與發(fā)文量最多，發(fā)文數(shù)量為18篇，其次是俄羅斯土壤科學(xué)理化與生物問題研究所和德國(guó)基爾大學(xué)。中國(guó)科學(xué)院、中國(guó)科學(xué)院大學(xué)、成都理工大學(xué)及中國(guó)環(huán)境科學(xué)院為主要國(guó)內(nèi)參與發(fā)文機(jī)構(gòu)。如圖3所示，圓圈大小表示發(fā)文數(shù)量的多少，連線是表示不同研究機(jī)構(gòu)間聯(lián)系的密切程度。德國(guó)哥廷根大學(xué)和基爾大學(xué)為土壤原位酶譜技術(shù)研究的中心，基本所有的發(fā)文機(jī)構(gòu)均與這兩所大學(xué)有合作。其中哥廷根大學(xué)的農(nóng)業(yè)土壤系及溫帶生態(tài)系統(tǒng)土壤系和基爾大學(xué)的土壤科學(xué)與植物營(yíng)養(yǎng)系為主要研究實(shí)驗(yàn)室。

圖3 土壤原位酶譜技術(shù)論文產(chǎn)出的主要研究機(jī)構(gòu)之間的合作

表1 土壤原位酶譜技術(shù)研究發(fā)文的國(guó)家/地區(qū)

2.3 發(fā)文的國(guó)際刊物

由HistCite軟件分析結(jié)果(表2)可見，共有10種期刊刊載了土壤原位酶譜技術(shù)相關(guān)論文，其中發(fā)文量最多的期刊是SoilBiology&Biochemistry，占發(fā)文總量的 59%。其次為PlantandSoil和BiologyandFertilityofSoils，分別占發(fā)文量的10%和7%。土壤原位酶譜技術(shù)相關(guān)論文在SoilBiology&Biochemistry，總被引次數(shù)為350次；其次為PlantandSoil，總被引次數(shù)為59次。但是土壤原位酶譜技術(shù)相關(guān)論文的篇均被引頻次和五年影響因子最高的期刊為TrendsinPlantScience，篇均被引次數(shù)為48次，該期刊的五年影響因子為14.0。期刊SoilBiology&Biochemistry發(fā)表的土壤原位酶譜技術(shù)相關(guān)論文的篇均被引頻次為20.6次。期刊的學(xué)科類別有5種，分別為土壤科學(xué)(soil science)、植物科學(xué)(plant sciences)、農(nóng)藝學(xué)(agronomy)、環(huán)境科學(xué)(environmental science)和毒理學(xué)(toxicology)。

表2 土壤原位酶譜技術(shù)研究領(lǐng)域發(fā)文的期刊

2.4 主要研究學(xué)者

通過HistCite軟件分析結(jié)果可見，參與土壤原位酶譜技術(shù)領(lǐng)域研究的學(xué)者目前共有79人。其中參與發(fā)文量大于2篇(包括2篇)的共有29人。如圖4所示，圓圈大小表示發(fā)文數(shù)量，連線是研究學(xué)者之間的相互合作關(guān)系。其中，Razavi B S發(fā)文數(shù)量最多為18篇，其次為Kuzyakov Y和Blagodatskaya E，分別參與發(fā)文數(shù)量為16和10篇。多數(shù)研究者均與以上3位研究者有合作關(guān)系。土壤原位酶譜相關(guān)論文的總被引次數(shù)最多的研究學(xué)者是Kuzyakov Y，為385次，其次為Razavi B S和Spohn M，總被用次數(shù)分別為218和213次，Blagodatskaya E的總被用次數(shù)為163次。

圖4 發(fā)文數(shù)量(≥2)的研究學(xué)者之間的合作關(guān)系

2.5 土壤原位酶譜技術(shù)的研究熱點(diǎn)

論文中關(guān)鍵詞可以簡(jiǎn)要表達(dá)文章的主要研究?jī)?nèi)容，所以一個(gè)關(guān)鍵詞出現(xiàn)的頻率越大，說明相關(guān)的主題為主要研究熱點(diǎn)。在關(guān)鍵詞共線網(wǎng)絡(luò)中，與土壤原位酶譜技術(shù)(soil zymography)關(guān)系密切的有空間分布(spatial distribution)、根際(rhizosphere)、磷酸酶活性(phosphatase activity)、酶活性(enzyme activities)、熱點(diǎn)(hotspots)、微生物群落結(jié)構(gòu)(microbial community structure)、微生物量(microbial biomass)、機(jī)制(mechanisms)、碳(carbon)等(圖5)。土壤原位酶譜技術(shù)不僅可以可視化多種酶活性的空間分布特征，還可以確定植物根際的區(qū)域大小，進(jìn)而可以精確地從根際區(qū)域采集土壤進(jìn)行土壤微生物量和微生物群落結(jié)構(gòu)等的分析，為探索土壤-微生物-植物之間的相互作用機(jī)理提供了更好的途徑。目前可運(yùn)用土壤原位酶譜技術(shù)可視化的酶共有10種，其中磷酸酶作為酶活性相關(guān)的關(guān)鍵詞出現(xiàn)的頻次較高，說明了對(duì)土壤磷素研究是目前土壤科學(xué)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

圖5 土壤原位酶譜技術(shù)研究論文中重要關(guān)鍵詞的共線網(wǎng)絡(luò)

3 小結(jié)與展望

本文利用Web of Science數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)土壤原位酶譜領(lǐng)域的研究論文進(jìn)行了文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)分析。結(jié)果表明，在全球范圍內(nèi)對(duì)土壤原位酶譜領(lǐng)域的研究越來越重視。土壤原位酶譜領(lǐng)域是土壤學(xué)科和植物學(xué)科的重要交叉領(lǐng)域，研究學(xué)者對(duì)土壤原位酶譜技術(shù)更廣泛的應(yīng)用和重視對(duì)土壤學(xué)和植物學(xué)的發(fā)展起到了積極的推動(dòng)作用。德國(guó)、俄羅斯、中國(guó)和美國(guó)的等國(guó)家在該領(lǐng)域發(fā)文較多，其中德國(guó)哥廷根大學(xué)和基爾大學(xué)為該領(lǐng)域研究的中心。不同機(jī)構(gòu)的研究學(xué)者合作緊密，以Kuzyakov Y和Razavi B S為高頻次被引學(xué)者。土壤原位酶譜技術(shù)的主要發(fā)文期刊為SoilBiology&Biochemistry。土壤原位酶譜技術(shù)未來研究趨勢(shì)主要集中于根際。根際是土壤與植物連接的最為活躍的區(qū)域，土壤原位酶譜技術(shù)可以結(jié)合微生物高通量測(cè)序技術(shù)以及同位素示蹤技術(shù)，更好地促進(jìn)對(duì)根際區(qū)域的微生物群落、根系分泌物代謝機(jī)理、土壤-植物互作(例如土傳病害)、碳氮磷等元素的利用效率、植物光合碳分配問題、重金屬對(duì)土壤根系和微生物的影響等方面的研究。但是，土壤原位酶譜技術(shù)在操作方式、應(yīng)用環(huán)境、底物濃度選擇及后期圖像數(shù)值化處理等方面依然存在不足，有待進(jìn)一步規(guī)范和優(yōu)化。