邱 紅，李艷紅，王曉君，呂 勤

（寧波市婦女兒童醫(yī)院，浙江寧波 315000）

目前，壞死性小腸結腸炎（necrotizing enterocoli?tis，NEC）仍然是構成新生兒死亡率及患病率增加的主要原因［1］。NEC 嚴重影響消化系統(tǒng)功能，甚至引起休克、酸中毒等癥狀［2］。由于缺乏可靠的和可預測的生物標記物，加上缺乏有效的治療，NEC 仍是導致早產嬰兒疾病的嚴重問題，闡明NEC 發(fā)病相關基因的潛在作用具有重要意義。攝食調節(jié)肽nesfa?tin-1 是一種來源于核結合蛋白2 的82 個氨基酸多肽，其在胃腸道、胰腺和內分泌腺中表達，在調節(jié)食物攝入、能量/葡萄糖穩(wěn)態(tài)和腸道運動中發(fā)揮重要作用［3-4］。除了在創(chuàng)傷性腦損傷、蛛網膜下腔出血和睪丸損傷中的抗炎和抗凋亡作用外，還有研究報道了nesfatin-1通過直接抗炎機制在胃和結腸中發(fā)揮保護作用［5］。然而nesfatin-1在NEC 胃腸道損傷中的影響尚未見報道。Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）屬于TLR 家族，在免疫炎癥反應中起著關鍵作用［6］。缺氧、手術、感染和其他應激因素觸發(fā)TLR4級聯(lián)并激活核因子κB 信號通路，提高趨化因子和炎癥因子的表達［7］。阻斷TLR4 介導的炎癥反應有助于防止胃腸炎發(fā)生［8］。盡管nesfatin-1 已被報道抑制結腸炎中TLR4 信號激活［9］，但其對NEC 的影響在很大程度上是未知的。在本研究中，我們檢測了在NEC 組織和LPS 誘導的腸細胞中nesfatin-1的表達水平，并評估了nesfatin-1 對免疫應答及對免疫應答的影響及其潛在機制。

材料和方法

1 材料

胎牛血清購自Gibco；DMEM/F-12 培養(yǎng)基購自HyClone；Lipofectamine 2000 購自Invitrogen；白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-10 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的ELISA試劑盒購自Abcam；Trizol試劑、RNA PCR試劑盒和SYBR Green I購自TaKaRa；StepOne Plus 實時熒光定量PCR 系統(tǒng)購自Applied Biosystems；RIPA裂解緩沖液購自Solar?bio；BCA 試劑盒購自Pierce；抗nesfatin-1、TLR4、NLRP3、caspase-1、黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma-2，AIM2）、含CARD 的凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）和GAPDH 單克隆抗體均購自Abcam；HRP 標記的Ⅱ抗購自Boehringer；ECL 購自Luminata Forte；Protein A/G購自Abcam。

2 方法

2.1 組織樣本采集 2017～2019年間，從在本院接受NEC 腸道手術的20 例早產兒中獲得了小腸組織。早產兒（男孩12 例和女孩8 例）的平均胎齡為30.3±1.9 周，出生體重為1202±119 g。NEC 的診斷標準參照《實用新生兒學》［2］，即：常以腹脹、便血為首發(fā)表現，可伴有嘔吐、腹瀉及全身癥狀，X 線腸壁囊樣積氣或門脈積氣征為特征性表現。手術切除后立即采集組織樣本，并將其保存在?80℃下。

2.2 細胞培養(yǎng) 人胎正常結腸上皮細胞HCoEpiC和人結腸癌細胞Caco-2 購自中國科學院細胞中心，接種在含有10%胎牛血清的DMEM/F-12 培養(yǎng)基中。HCoEpiC 細胞和Caco-2 細胞以5×107/L 接種于96 孔板中，加入100 μg/L 的LPS 處理30 min，建立腸細胞的NEC模型。

2.3 轉染實驗 當腸上皮細胞培養(yǎng)至70%～80%匯合后，使用Lipofectamine 2000 將nesfatin-1 過表達載體及其陰性對照載體，以及pcDNA-TLR4（均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成）轉染細胞。將所有轉染的細胞培養(yǎng)48 h，然后進行不同的測定。Western blot檢測nesfatin-1的表達確定轉染效率。

2.4 ELISA檢測炎癥因子的濃度 使用ELISA試劑盒檢測細胞中IL-6、IL-10和TNF-α的相對表達水平。通過分光光度法測定450 nm 處吸光度（A）。根據標準曲線計算炎癥因子濃度。

2.5 RT-qPCR 分析 使用Trizol試劑從小腸組織或細胞中提取總RNA。使用RNA PCR試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，然后使用StepOnePlus實時熒光定量PCR 系統(tǒng)進行實時定量PCR。PCR 反應混合物使用SYBR Green I、cDNA 和引物。使用常規(guī)2?ΔΔCt法計算目的基因的表達變化。TNF-α的上游引物序列為5′-CGCCTCACCTGACCTACC-3′，下游引物序列為5′-TTGCCTCGTTCTGGACTATAC-3′；IL-6 的上游引物序列為5′-CACCTATGCCACCCTTATCC-3′，下游引物序列為5′-CGAACATGCGAGTAAACCAA-3′；IL-10 的上游引物序列為5′-ATGCTGCCTGCTCTTACT?GACTG-3′，下游引物序列為5′-CCCAAGTAACCCT?TAAAGTCCTGC-3′；nesfatin-1的上游引物序列為5′-CCTATGCCCTAAGAAACCCC-3′，下游引物序列為5′-GAAGCAGTTTGGGACCCCTT-3′；TLR4的上游引物序列為5′-ACCTGTCACTGTCTTGTACCCTTGT-3′，下游引物序列為5′-CGGCGTTTGGAGTGG?TAGAA-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-AGCAAT?GCCTCCTGCACCACCAAC-3′，下游引物序列為5′-CCGGAGGGGCCATCCACAGTCT-3′。

2.6 Western blot 分析 用RIPA裂解緩沖液裂解腸細胞。通過BCA 法測定蛋白濃度。在100℃下用加載緩沖液將裂解物變性5 min，然后在SDS-PAGE（12%）上加載相同的蛋白質并轉移到PVDF 膜上，用阻斷劑消除非特異性染色。這些膜用Ⅰ抗［nesfatin-1（1∶1 000）、TLR4（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、cas?pase-1（1∶1 000）、AIM2（1∶1 500）、ASC（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）］在4℃封閉過夜。然后用PBS 洗滌，并用HRP標記的II抗和ECL孵育觀察目標條帶。

2.7 免疫共沉淀實驗 用RIPA 裂解緩沖液對HCoEpiC 細胞進行裂解。用PBS 稀釋Protein A/G-瓊脂糖至50%的工作濃度。然后將溶液加入樣品（100 mL/L）中，在4℃下?lián)u勻10 min。14 000×g離心10 min 后，收集上清液轉移至新離心管中。用BCA法測定蛋白質濃度。加入兔抗nesfatin-1 IgG 抗體或對照兔IgG 室溫孵育2 h，分別加入Protein A/G（1∶50）10 μL 孵育1 h。離心收集沉淀進行電泳并對TLR4蛋白進行Western blot分析。

3 統(tǒng)計學處理

數據用平均值±標準差（mean±SD）表示。用t檢驗法比較組織標本和腸上皮細胞中nesfatin-1 的表達。采用雙向方差分析法分析nesfatin-1對炎癥的影響。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 在NEC 組織和LPS 誘導的腸細胞中nesfatin-1的mRNA表達下調

如圖1A 所示，NEC 早產兒組織中nesfatin-1的表達明顯低于健康組（P＜0.01）。此外，與對照組相比，LPS 誘導的腸上皮HCoEpiC 細胞和HT-29 細胞中的nesfatin-1表達降低（P＜0.01），見圖1B。

Figure 1.The mRNA expression of nesfatin-1 was detected in NEC tissues（A）and LPS-induced intestinal epithelial cells（B）.The mRNA expression of nesfatin-1 was detected by RT-qPCR.Mean±SD.##P＜0.01 vs healthy group；**P＜0.01 vs control group.圖1 在NEC患兒組織和LPS誘導的腸上皮細胞中檢測nesfatin-1的mRNA表達水平比較

2 nesfatin-1 減弱LPS 刺激腸細胞中炎癥因子和相關蛋白的表達

為了確定nesfatin-1 對炎癥因子的影響，研究檢測了LPS 刺激腸細胞中TNF-α、IL-10、IL-6 和NLRP3的表達。分別用陰性對照（NC）和pcDNA-nesfatin-1（nesfatin-1）轉染細胞，然后用100 μg/L 的LPS 刺激，通過Western blot 分析顯示，與NC 轉染組相比，nes?fatin-1 轉染組中nesfatin-1 蛋白表達顯著提高（P＜0.05），并且LPS 刺激顯著降低nesfatin-1 蛋白的表達（P＜0.05），而nesfatin-1 轉染逆轉了LPS 的刺激作用（圖2A、B）。ELISA 結果表明，nesfatin-1 的過表達降低了TNF-α 和IL-6 的水平（P＜0.05），并增加了IL-10的水平（P＜0.05），見圖2C～E。此外，在HCoEpiC 細胞和HT-29 細胞中，nesfatin-1 轉染抑制了NLRP3、AIM2、caspase-1和ASC的表達（圖2F）。

3 nesfatin-1與TLR4的交互作用

本研究中，TLR4 在NEC 組織樣本中的表達明顯高于健康嬰兒（P＜0.05），見圖3A。Pearson相關分析表明，nesfatin-1 和TLR4 之間存在顯著負相關（r=?0.816，P＜0.01），見圖3B。nesfatin-1 轉染逆轉了LPS 誘導的HCoEpiC 細胞和Caco-2 細胞中TLR4 蛋白的表達增加（P＜0.05），見圖3C。此外，通過免疫沉淀發(fā)現TLR4與nesfatin-1能夠在細胞內共沉淀，見圖3D。

Figure 2.Nesfatin-1 inhibited the expression of inflammatory factors and related proteins in the HCoEpiC cells and Caco-2 cells with LPS stimulation.A and B：over-expression efficiency of nesfatin-1 was investigated by Western blot；C～E：ELISA was used to measure the contents of TNF-α，IL-6 and IL-10 in the HCoEpiC cells and Caco-2 cells；F：the protein expression of NLRP3，AIM2，caspase-1 and ASC was investigated by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 NC+LPS group；△P＜0.05 vs HCoEpiC-NC group；▲P＜0.05 vs Caco-2-NC group.圖2 nesfatin-1抑制LPS刺激下HCoEpiC細胞和HT-29細胞炎癥因子和相關蛋白的表達。

4 TLR4逆轉nesfatin-1對炎癥反應的影響

進一步分析了TLR4 在HCoEpiC 細胞炎癥反應中的作用。用特異性質粒載體轉染HCoEpiC 細胞，轉染48 h后采集標本，用RT-qPCR法測定IL-6、IL-10和TNF-α 的mRNA 水平，Western blot 檢測NLRP3、AIM2、caspase-1 和ASC 的蛋白水平。結果表明，TLR4 轉染促進LPS 誘導的HCoEpiC 細胞IL-6 和TNF-α 的表達（P＜0.05），并消除了nesfatin-1 對HCo?EpiC 細胞IL-10 表達的增強作用（P＜0.05），見表1。此外，TLR4 的過表達進一步促進了LPS 誘發(fā)的NL?RP3 升高，并逆轉了nesfatin-1 對NLRP3、AIM2、cas?pase-1和ASC蛋白水平的抑制作用，見圖4。

討 論

隨著新生兒重癥監(jiān)護技術的發(fā)展，早產兒的存活率明顯提高，然而這些新生兒的NEC 發(fā)病率也相應上升［10］。NEC 的發(fā)病機制，包括從輕度炎癥到腸壞死并多器官功能衰竭，目前尚不清楚。在重癥監(jiān)護期間，缺血、缺氧和缺乏母乳喂養(yǎng)，破壞了已經不成熟的腸道屏障，氧化應激、感染與炎癥反應產生或釋放的氧自由基、炎性細胞因子活化與NEC 明顯相關［11］。因此，大量關于NEC 預防和治療的研究集中于增強抗炎防御和限制炎癥損傷藥物的應用［12］。nesfatin-1 是細胞因子信號轉導的關鍵調節(jié)因子，在細胞免疫應答和炎癥性疾病中發(fā)揮作用［3］。王鼎元等［13］研究表明，nesfatin-1 對巨噬細胞的自身免疫炎癥有負調節(jié)作用。此外，nesfatin-1 被認為是胃腸道炎癥的重要介質［14］。胃上皮細胞nesfatin-1基因敲除促進胃炎的發(fā)生［3］；而nesfatin-1 的過度表達提高了結腸上皮細胞的傷口愈合能力，并降低了潰瘍性結腸炎的病變風險［4］。本研究結果證實Nesfatin-1 在NEC 嬰兒組織樣本和LPS 誘導的腸細胞中下調，并減輕NEC的作用。

Figure 3.Nesfatin-1 interacted with TLR4.A：the mRNA expression of TLR4 in intestinal epithelial cells was detected by RTqPCR；B：the relation between nesfatin-1 and TLR4 was determined by Pearson analysis in the intestinal epithelial cells；C：the cells were transfected with NC or nesfatin-1，and then the protein expression of TLR4 in HCoEpiC cells and Caco-2 cells was detected by Western blot；D：the images of co-immunoprecipitation assay showed nesfatin-1-TLR4 interaction.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs healthy group；#P＜0.05 vs NC+LPS group.圖3 nesfatin-1與TLR4交互作用的驗證

表1 TLR4逆轉了nesfatin-1對腸細胞炎癥反應的影響Table 1.TLR4 reversed the effect of nesfatin-1 on intestinal inflammatory responses（Mean±SD. n=3）

nesfatin-1 在各種胃腸道疾病中異常表達，可通過靶向多種轉錄因子介導免疫應答［4］。Xia 等［15］研究證實血漿nesfatin-1 水平升高與皮質酮、IL-6 和CRP 水平降低有關。nesfatin-1 負性調節(jié)CD33 的表達，導致炎癥細胞因子的表達減少［16］。本研究發(fā)現，在HCoEpiC 細胞和HT-29 細胞中，nesfatin-1 轉染抑制了LPS刺激誘導的NLRP3、AIM2、caspase-1和ASC蛋白的表達。NLRP3炎癥小體是研究最多的炎癥小體，其持續(xù)和過度激活導致急性和慢性炎癥疾病的爆發(fā)。通常當炎癥小體被刺激激活時，激活的炎癥小體會將caspase-1 前體切割成caspase-1。caspase-1反過來又調節(jié)促炎細胞因子如IL-6 和TNF-α 的成熟，過量的IL-6 可導致各種炎癥疾?。?7］。AIM2 是識別微生物或宿主來源dsDNA 的胞質傳感器之一，其過度激活導致自身免疫性疾病的發(fā)展［18］。在炎癥小體復合物形成過程中，集合適配器ASC 是與NLRP3、AIM2 結構域和caspase-1 前體相互作用的銜接蛋白［19］。

Figure 4.The protein expression of NLRP3，AIM2，caspase-1 and ASC was determined by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs LPS group；#P＜0.05 vs nesfatin-1+LPS group.圖4 Western blot檢測NLRP3、AIM2、caspase-1和ASC蛋白的表達

近年來，nesfatin-1在TLR4應答中的作用引起了研究者的關注。Roth 等［20］研究證明，TLR4 應答是由nesfatin-1介導的，nesfatin-1阻斷核移位和轉錄活性。沙格列汀可提高nesfatin-1 的表達，抑制炎癥反應，TLR4 抑制劑可減弱沙格列汀對nesfatin-1 的促進作用［21］。在本研究中，我們發(fā)現nesfatin-1直接與TLR4結合，抑制LPS 誘導的免疫反應。進一步分析顯示，TLR4 的轉染促進LPS 誘導的HCoEpiC 細胞IL-6、TNF-α 和NLRP3 的表達升高，并消除了nesfatin-1 對HCoEpiC 細胞IL-10 表達的增強作用以及nesfatin-1對NLRP3、AIM2、caspase-1 和ASC 蛋白表達的抑制作用。結果表明nesfatin-1 通過靶向TLR4 介導LPS誘導的腸細胞炎癥反應。

綜上所述，本研究表明nesfatin-1 在NEC 和LPS誘導的腸上皮細胞中表達較低。nesfatin-1的過度表達減弱了HCoEpiC 細胞和HT-29 細胞的炎癥反應。此外，nesfatin-1 通過靶向TLR4 介導炎癥反應保護腸細胞免受LPS 誘導的炎癥反應損傷，可能成為抗NEC治療的潛在靶點。