歐陽穎，曾愛紅，張羚枚，周瑞瑜，唐淑敏，阮揚(yáng)皓，李伍鳳

（中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院兒科，廣東廣州 510120）

新生兒缺氧缺血性腦?。╤ypoxic-ischemic en?cephalopathy，HIE）是新生兒窒息后的嚴(yán)重并發(fā)癥，是引起智能落后、癲癇、共濟(jì)失調(diào)和腦性癱瘓［1］的主要原因之一。據(jù)報(bào)道，近10年來HIE的發(fā)病率大約在（2～3）/1 000 例活產(chǎn)新生兒［2-3］。到目前為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)新生兒缺氧缺血性腦病的治療，主要包括支持治療和對(duì)癥治療，但均對(duì)已有的腦損傷無作用。因此，尋找更為有效的治療方法成為當(dāng)前急需解決的問題。

HIE 是圍產(chǎn)期新生兒缺氧、缺血引起的腦部病變，在大多數(shù)情況下，缺氧和缺血同時(shí)發(fā)生，但缺血對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷更大。缺氧缺血性腦病發(fā)病機(jī)理極為復(fù)雜，現(xiàn)階段普遍認(rèn)為HIE 是代謝障礙、酸中毒、興奮性氨基酸的毒性作用、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等一系列病理作用的結(jié)果［4-6］。因此，明確HIE 的發(fā)病機(jī)制、尋找高效且副作用少的治療方法具有重要的意義。

丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate，EP）是丙酮酸的酯化物，是一種化學(xué)性能穩(wěn)定、親脂性的小分子化合物，能迅速穿過細(xì)胞膜和線粒體［7］。EP 的主要藥理作用包括提供能量代謝物，保護(hù)細(xì)胞免受氧化產(chǎn)物和自由基的侵害，抑制炎癥反應(yīng)［8-11］。有報(bào)道稱EP通過核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）/血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）通路激活內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)［10］。此外，EP 還通過與P65［11］相互作用抑制NF-κB的活性，降低早期腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）等炎癥因子的表達(dá)，下調(diào)［12］晚期HMGB1的合成和釋放。因此，EP 有望通過逆轉(zhuǎn)HIE 的病理過程，發(fā)揮更大的神經(jīng)保護(hù)作用。研究EP 作用下體外培養(yǎng)新生大鼠顆粒神經(jīng)元Nrf2/ARE/HO-1 信號(hào)通路的激活狀態(tài)并探討其機(jī)制，將為HIE未來臨床治療提供參考資料。

材料和方法

1 主要試劑

基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)液和新生小牛血清購自Gibco BRL；胰酶、脫氧核糖核酸酶、胰酶抑制劑、阿糖胞苷、核糖核酸酶、谷氨酸（glutamate，Glu）、多聚賴氨酸、二乙酸熒光素（fluorescein diacetate，F(xiàn)DA）、碘化丙 啶（propidium iodide，PI）、Hoechst 33258、EP 和MK-801 均購自Sigma；硫酸慶大霉素購自福建三明制藥廠；Triton X-100和氯仿購自Merck；飽和重蒸酚溶液購自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒購自寧波唯奧公司；H2-DCF-DA 購自Invitrogen；抗Nrf2 和HO-1 抗體購自Stressgen；MTT 購自Sigma-Aldrich；二氫乙啶（dihy?droethidium，DHE）和4%多聚甲醛購自Sigma。

2 小腦顆粒神經(jīng)元培養(yǎng)

按文獻(xiàn)方法［13］，取新生7 d 的Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌雄不拘，在無菌條件下斷頭、開顱，取小腦，放在解剖液［10×Krebs 緩沖液（NaCl 72.5 g，KCl 4.0 g，NaH2PO41.4 g，右旋糖26 g，苯酚紅100 mg，EP 59.6 g/L，pH 7.4）15 mL，白蛋白0.45 g，3.82%MgSO41.2 mL，pH 7.4］中，顯微鏡下去除血管和腦膜。然后用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm 大小的組織塊，胰酶（0.25 g/L）消化（37℃，15 min），立即加反應(yīng)終止液I（含胰酶抑制劑0.52 g/L、DNase-I 0.08 mg/L和Mg2+3 mmol/L 的解剖液）混勻、離心、棄上層，沉淀加反應(yīng)終止液II（含Mg2+3 mmol/L 和Ca2+100 μmol/L 的解剖液）2 mL 反復(fù)吹打，離心（319×g，30 s），去除未消化的組織，細(xì)胞懸液再離心（958×g，5 min），棄上層，細(xì)胞沉淀以完全培養(yǎng)液（BME，25 mmol/L KCl，谷氨酰胺20 mmol/L，10%胎牛血清，0.1 g/L 硫酸慶大霉素）分散，按（1.5～1.8）×109/L 種植在預(yù)先鋪有多聚賴氨酸（5 mg/L）的培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，細(xì)胞數(shù)為（2～3）×106/cm2。然后置于CO2培養(yǎng)箱中（37℃，5% CO2）培養(yǎng)。24 h 后，加阿糖胞苷（終濃度為10 μmol/L）。7 d 后，加葡萄糖（終濃度為5 mmol/L）。以后每隔4 d 按前法加一次葡萄糖。7 d后，神經(jīng)元分化成熟。

3 Glu興奮性模型建立與實(shí)驗(yàn)分組

將體外培養(yǎng)7 d 的小腦顆粒神經(jīng)元隨機(jī)分為：（1）空白對(duì)照（control）組；（2）Glu 組［參考文獻(xiàn)［13］，棄去培養(yǎng)液，加入Locke 溶液（含154 mmol/L NaCl，5.6 mmol/L KCl，3.6 mmol/L NaHCO3，2.3 mmol/L CaCl2，5.6 mmol/L glucose，10 mmol/L HEPES，pH 7.4）和1 mol/L 甘氨酸，以充分激活NMDA 敏感的Glu 識(shí)別位點(diǎn)，Glu 濃度為100 μmol/L，30 min 后換成普通的完全培養(yǎng)液］；（3）Glu+EP 組［在（2）組基礎(chǔ)上加入不同濃度（0.1、0.5、1、2.5 和5 mmol/L）的EP。每組有8個(gè)復(fù)孔。

4 主要方法

4.1 FDA/PI 熒光染色 用FDA 和PI 分別對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行染色。將待處理的細(xì)胞，棄培養(yǎng)液后，以含糖的PBS 洗1 遍，加入FDA（10 mg/L）和PI（4 mg/L），于暗室37℃孵育5 min，棄染液后以含糖的PBS 洗2 遍，熒光顯微鏡下拍照，每組隨機(jī)選3 個(gè)視野拍照。與正常對(duì)照組比較，計(jì)算存活率。細(xì)胞存活率（%）=各處理組的活細(xì)胞數(shù)/正常對(duì)照組的活細(xì)胞數(shù)×100%。

4.2 MTT 實(shí)驗(yàn) 取培養(yǎng)7 d 的小腦顆粒細(xì)胞，在給藥相應(yīng)時(shí)間后，加入新鮮配制的MTT（溶于PBS，5 g/L）20 μL，將細(xì)胞置于含5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中孵育4～6 h后去除培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜溶解結(jié)晶體，待結(jié)晶體完全溶解后，在酶標(biāo)儀上（測(cè)定波長(zhǎng)570 nm，參考波長(zhǎng)630 nm）測(cè)吸光度（A），細(xì)胞存活率（%）=A處理組/A對(duì)照組×100%。

4.3 細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度（intracellular free calcium concentration，［Ca2+］i）的測(cè)定 用培養(yǎng)第7 d 的細(xì)胞，經(jīng)5 μmol/L的Fluo-3/AM負(fù)載60 min，用Hanks液洗滌3次，放在倒置熒光顯微鏡下，由自動(dòng)灌洗儀持續(xù)灌流緩沖液。應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)Fluo-3 的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)526 nm），每組選取20個(gè)活細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞間隔2 s掃描1 次，共掃描16 次，記錄16 個(gè)熒光強(qiáng)度數(shù)值，取平均值為該細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。根據(jù)公式計(jì)算：［Ca2+］i=Kd（F?Fmin）/（Fmax?F），Kd為Fluo3 與Ca2+反應(yīng)的解離常數(shù)，在室溫下為400 nmol/L；F 為實(shí)驗(yàn)記錄到的熒光強(qiáng)度值；Fmax為最大熒光值，加入5 mmol/L CaCl2的EGTA 溶液所測(cè)得的值；Fmin為最小熒光值，由在無Ca2+緩沖液中加入10 mmol/L EGTA測(cè)得。

4.4 H2-DCF-DA 檢測(cè) ROS 在Glu 模型作用后90 min，棄去培養(yǎng)液，使用PBS 清洗3 次后，加入終濃度為30 μmol/L 的H2-DCF-DA，在37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，用PBS清洗1次，迅速置于熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)及吸收波長(zhǎng)采用475 nm/525 nm。

4.5 DHE 檢測(cè)超氧陰離子 在Glu 模型作用后90 min，棄去培養(yǎng)液，使用PBS 清洗3 次后，加入終濃度為10 μmol/L 的DHE，在37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，用PBS清洗1次，迅速置于多功能熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)及吸收波長(zhǎng)采用485 nm/535 nm。

4.6 Western blot 根據(jù)試劑盒說明，提取細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白，于?80℃保存，后與DTT 混合、煮沸、離心，使蛋白質(zhì)變性，取上清20 μL 于200 V 進(jìn)行SDS-PAGE 45 min；取出硝酸纖維膜，浸入TBS+TBST+5%脫脂奶粉溶液，室溫封閉2 h，在10 mL I 抗稀釋液中把NC 膜和I抗共同輕搖孵育，4℃過夜。第2天，用1×TBST 洗NC 膜3次（每次15 mL，5 min），把NC 膜與溶解在10 mL 封閉液中的與HRP 結(jié)合的Ⅱ抗（適當(dāng)比例稀釋）和HRP 結(jié)合的抗生物素抗體（1∶1 000）室溫下共同孵育1 h；用1×TBST 洗NC 膜3 次（每次15 mL，5 min），與10 mL 1× LumiGLO（含0.5 mL 20×底物B和9.0 mL水）室溫下輕搖1 min。排去過量的液體，在暗室中使其與X 光片在增感屏中緊密接觸，使X 光片感光數(shù)秒到數(shù)分鐘。顯影，定影，沖洗，晾干，拍照并進(jìn)行計(jì)算機(jī)圖像分析。

4.7 免疫組化 細(xì)胞用PBS 溶液洗2 次，后用4%多聚甲醛固定在室溫下30 min。然后再用PBS 洗2次，通過0.5% Triton X-100 在室溫下孵化15 min。10%的細(xì)胞封鎖在山羊血清，室溫1 h。4℃孵育過夜。PBS 洗滌3 次，室溫下用稀釋的熒光抗體孵育1.5 h。室溫下用Hoechst 33258 染色細(xì)胞核15 min，PBS洗滌3次后，激光共聚焦顯微鏡成像。

4.8 ARE誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè) 用Promega公司雙螢光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)熒光強(qiáng)度。所有的程序都是按照制造商的指示進(jìn)行的。pGL6-ARE-Luc 質(zhì)粒是基于pGL6 載體構(gòu)建，ARE 序列為3 個(gè)串聯(lián)的CACCGTGACTCAGCAATT，并在我們的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行。誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性增加倍數(shù)=（藥物誘導(dǎo)的螢火蟲螢光素酶活性/藥物誘導(dǎo)的海腎螢光素酶活性）/（對(duì)照組誘導(dǎo)的螢火蟲螢光素酶活性/對(duì)照組誘導(dǎo)的海腎螢光素酶活性）。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3.1 加強(qiáng)電力需求側(cè)管理。在現(xiàn)有用戶負(fù)荷管理范圍內(nèi)，選取部分可中斷負(fù)荷，建設(shè)毫秒級(jí)精準(zhǔn)負(fù)荷控制系統(tǒng)，優(yōu)化升級(jí)現(xiàn)有負(fù)荷管理系統(tǒng)。應(yīng)用大數(shù)據(jù)平臺(tái)，試點(diǎn)對(duì)用戶用電行為開展實(shí)時(shí)分析，進(jìn)一步挖掘其在用電預(yù)測(cè)、錯(cuò)峰調(diào)度等方面潛力，促進(jìn)供需互動(dòng)。

結(jié) 果

1 EP對(duì)小腦顆粒神經(jīng)元的保護(hù)作用

如圖1 所示，EP 對(duì)原代培養(yǎng)神經(jīng)元Glu 興奮性毒性的抑制作用呈劑量依賴性。100 μmol/L Glu 對(duì)原代培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元有明顯的損傷作用，表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞體積異常，軸突/樹突斷裂和消失。FDA/PI雙染色下可見正常組絕大部分細(xì)胞染成綠色，夾雜著少許紅染的細(xì)胞，Glu 組則綠染細(xì)胞減少，而紅色的死細(xì)胞明顯增多。1 mmol/L EP 預(yù)處理30 min 后，Glu 誘導(dǎo)損傷下存活神經(jīng)元數(shù)量顯著增加（P＜0.05），EP以濃度依賴性的方式顯著提高了神經(jīng)元的活力。

2 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)結(jié)果

我們通過H2-DCF-DA 檢測(cè)小腦顆粒神經(jīng)元的ROS 含量，用DHE 檢測(cè)超氧陰離子含量。H2-DCFDA 染色后，含ROS 的細(xì)胞發(fā)綠色熒光，ROS 越多，熒光強(qiáng)度越大。與正常對(duì)照組少量的綠色熒光細(xì)胞相比，Glu 組可見到綠色熒光細(xì)胞明顯增多，熒光強(qiáng)度大；而Glu+EP 組則綠色熒光細(xì)胞明顯減少，熒光強(qiáng)度明顯減弱，見圖2。DHE 染色后，含超氧陰離子的細(xì)胞與DHE 作用而發(fā)出紅色熒光，超氧陰離子越多，熒光強(qiáng)度越大。與正常對(duì)照組少量紅色熒光細(xì)胞相比，Glu 組可見紅色熒光細(xì)胞明顯增多，熒光強(qiáng)度增大；而Glu+EP 組則紅色熒光細(xì)胞明顯減少，熒光強(qiáng)度較弱，見圖2。

3 小腦顆粒神經(jīng)元［Ca2+］i檢測(cè)結(jié)果

我們通過Fluo-3 作為指標(biāo)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+。在小腦顆粒神經(jīng)元中，加入Glu，動(dòng)態(tài)觀察［Ca2+］i水平，20 s 即可觀察到熒光強(qiáng)度迅速升高，達(dá)到高峰，隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，但6 min 時(shí)仍顯著高于正常；加入EP（2.5 和5.0 mmol/L）預(yù)處理30 min 可以部分阻滯［Ca2+］i升高（P＜0.05），見圖3。

4 EP通過激活Nrf2/ARE/HO-1通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用

通過檢測(cè)EP 處理神經(jīng)元中Nrf-2 的表達(dá)，觀察到EP 組中細(xì)胞質(zhì)Nrf2 表達(dá)下降，細(xì)胞核Nrf2 表達(dá)明顯上調(diào)，見圖4A。之后，在Nrf2 免疫組化染色后加入Hoechst 染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，正常對(duì)照組細(xì)胞漿染成紅色，核染成藍(lán)色，而EP 組中細(xì)胞質(zhì)染成紅色，細(xì)胞核內(nèi)因Nrf2明顯升高，核亦染成紅色，同時(shí)在Hoechst 染色后呈藍(lán)色，融合后核呈紅色，提示Nrf2 轉(zhuǎn)入核內(nèi)，見圖4B。在檢測(cè)ARE 的轉(zhuǎn)錄活性實(shí)驗(yàn)中，EP 組ARE 的轉(zhuǎn)錄活性顯著上調(diào)（P＜0.05），見圖4C。如圖4D 所示，Glu 或EP 處理3 h、6 h 和12 h 均顯著提高HO-1 的表達(dá)水平（P＜0.05），且Glu 和EP 共處理進(jìn)一步增加了HO-1 的表達(dá)。相反，HO-1 抑制劑鋅原卟啉（zinc protoporphyrin，ZnPP）部分抑制了EP的神經(jīng)保護(hù)作用，見圖4E。

討 論

1 Glu對(duì)體外培養(yǎng)小腦顆粒神經(jīng)元的毒性作用

本實(shí)驗(yàn)中，小腦顆粒神經(jīng)元在Glu作用后24 h存活率為（28.4±2.1）%，與文獻(xiàn)結(jié)果相符［14］。DNA 電泳未出現(xiàn)梯形條帶，呈涂布狀，提示主要的死亡方式為壞死。另一研究［15］的結(jié)果則不同，在沒有甘氨酸存在及無鎂離子的Locke 液的情況下，Glu 的毒性濃度選擇為300 μmol/L，但細(xì)胞存活率仍高于本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。因此，同樣為Glu模型，濃度不同，處理方式不同，細(xì)胞死亡的方式不同，Glu 引起細(xì)胞死亡所激活的通路可能不同。

2 EP對(duì)小腦顆粒神經(jīng)元的保護(hù)作用

EP 具有組織能量守恒、抗炎、抗氧化等藥理作用［16］，可減輕體內(nèi)的全身炎癥反應(yīng)和多臟器功能障礙［17］。有研究稱EP 可以治療重癥急性胰腺炎（se?vere acute pancreatitis，SAP），減輕SAP 相關(guān)的遠(yuǎn)端器官損傷，如肝、肺和腎［18-19］。此外，EP 能減輕外傷性腦損傷和出血性腦損傷［20］。

在本研究中，EP在濃度0.1～5 mmol/L時(shí)劑量依賴性地抑制Glu 的興奮性毒性作用，充分說明EP 具有神經(jīng)保護(hù)作用，可能為一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有應(yīng)用前景的藥物。

3 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)結(jié)果

4 EP抑制細(xì)胞內(nèi)鈣升高

Figure 1.Protective effect of ethyl pyruvate（EP）on rat cerebellar granule neurons.A-1：normal cerebellar granule neurons，scale bar=40 μm；A-2：cerebellar granule neurons treated with 100 μmol/L glutamate（Glu）for 24 h，scale bar=40 μm；A-3：cerebellar granule neurons treated with Glu（100 μmol/L）+EP（2.5 mmol/L）for 24 h，scale bar=40 μm；A-4：normal cer?ebellar granule neurons，F(xiàn)DA staining，scale bar=10 μm；A-5：cerebellar granule neurons treated with Glu（100 μmol/L）for 24 h，F(xiàn)DA staining，scale bar=10 μm；A-6：cerebellar granule neurons treated with Glu（100 μmol/L）+EP（2.5 mmol/L）for 24 h，F(xiàn)DA staining，scale bar=10 μm；A-7：normal cerebellar granule neurons，PI staining，scale bar=20 μm；A-8：cerebellar granule neurons treated with Glu（100 μmol/L）for 24 h，PI staining，scale bar=20 μm；A-9：cerebellar granule neurons treated with Glu（100 μmol/L）+EP（2.5 mmol/L）for 24 h，PI staining，scale bar=20 μm.B：the effect of EP（0.1～5 mmol/L）on the viability of Glu（100 μmol/L）-induced cerebellar granule neurons.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs Glu group.圖1 丙酮酸乙酯對(duì)大鼠小腦顆粒神經(jīng)元的保護(hù)作用

正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度為100 nmol/L，比細(xì)胞外的鈣低10 000倍。細(xì)胞間隙高濃度的Glu，可引起N-甲基-D 天冬氨酸受體過度興奮，Ca2+大量?jī)?nèi)流，［Ca2+］i短暫升高；經(jīng)過一段時(shí)間之后，出現(xiàn)第2次鈣離子升高，稱之為延遲性鈣失調(diào)，為不可逆損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。［Ca2+］i過高可聚集在線粒體內(nèi)，損傷氧化磷酸化通道，造成ATP 不足；另一方面，Ca2+與鈣調(diào)素形成復(fù)合物，激活多種蛋白酶，引起廣泛的信號(hào)傳導(dǎo)分子磷酸化，而產(chǎn)生各種細(xì)胞效應(yīng)；同時(shí)促進(jìn)氧自由基產(chǎn)生，故細(xì)胞內(nèi)鈣超載被認(rèn)為是細(xì)胞死亡的最后通路［22］。

Figure 2.Detection of ROS in rat cerebellar granule neurons.A：control group，H2-DCF-DA staining；B：glutamate（Glu；100 μmol/L）group，H2-DCF-DA staining；C：Glu（100 μmol/L）+ethyl pyruvate（EP；2.5 mmol/L）group，H2-DCF-DA stain?ing；D：control group，DHE staining；E：Glu（100 μmol/L）group，DHE staining；F：Glu（100 μmol/L）+EP（2.5 mmol/L）group，DHE staining.Scale bar=50 μm.圖2 大鼠小腦顆粒神經(jīng)元內(nèi)ROS檢測(cè)結(jié)果

Figure 3.Detection of［Ca2+］i in rat cerebellar granule neurons.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Glu group.圖3 大鼠小腦顆粒神經(jīng)元［Ca2+］i檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)中，Glu 組細(xì)胞內(nèi)鈣在20 s 左右迅速升高，持續(xù)6 min 以上。而EP+Glu 組細(xì)胞內(nèi)鈣較正常組升高，但顯著低于Glu組，提示EP通過抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，阻斷了引起神經(jīng)元損傷的上游通路。因此，抑制［Ca2+］i的升高在EP 的神經(jīng)保護(hù)作用中起到很重要的作用。

5 EP 通過激活Nrf2/ARE 通路而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用

Nrf2-ARE信號(hào)通路被認(rèn)為是一種新型的抗氧化信號(hào)通路，以Nrf2為核心，激活一些保護(hù)性的酶的產(chǎn)生，如HO-1、超氧化物歧化酶及還原型谷胱甘肽；HO-1 及還原型谷胱甘肽可抑制細(xì)胞凋亡，抗氧化，緩解細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載［23］。在顱腦外傷、顱內(nèi)出血和腦缺血梗死動(dòng)物模型中均有Nrf2-ARE 信號(hào)通路激活。有研究顯示，移植Nrf2 過度表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞至紋狀體可減輕丙二酸誘導(dǎo)的細(xì)胞損害［24］；應(yīng)用小干擾RNA 降低Nrf2 的表達(dá)，可引起NO 誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡增多［25］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在EP 處理組，Nrf2 轉(zhuǎn)運(yùn)入核中，12 h 核內(nèi)Nrf2 仍升高。免疫組化染色顯示核內(nèi)Nrf2 明顯增多，ARE 介導(dǎo)的熒光素酶轉(zhuǎn)錄活性升高，提示EP 激活Nrf2/ARE 通路，使ARE 轉(zhuǎn)錄活性增高。同時(shí)，Glu 引起HO-1 升高，證明Glu 的氧化性損傷也可引起HO-1 升高，但12 h 即下降，說明Glu 激發(fā)的HO-1 升高所起到的保護(hù)作用有限，而EP 可引起正常小腦顆粒細(xì)胞內(nèi)HO-1升高，與Glu一起，協(xié)同誘導(dǎo)HO-1升高，可發(fā)揮較強(qiáng)的抗氧化損傷作用。ZnPP部分阻滯EP 的保護(hù)作用，則說明HO-1 的保護(hù)作用是確切的。因此，EP 是通過激活Nrf2/ARE/HO-1 通路而起到保護(hù)作用。

綜上所述，我們的研究為EP 在體外對(duì)大鼠小腦顆粒神經(jīng)元Glu 興奮性神經(jīng)毒性的保護(hù)作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。EP 的作用機(jī)制包括抗氧化、減輕腦水腫、抑制細(xì)胞凋亡，而在HIE 發(fā)病過程中，Glu 興奮性毒性是腦損傷的主要環(huán)節(jié)，因此我們推斷EP 可能在HIE神經(jīng)保護(hù)治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

Figure 4.The expression of Nrf2/ARE/HO-1 pathway-related proteins in rat cerebellar granule neurons.A：ethyl pyruvate（EP；2.5 mmol/L）decreased cytoplasmic Nrf2，but increased nuclear Nrf2；B：cytoplasmic Nrf2 was translocated into the nucleus after treatment with 2.5 mmol/L EP for 6 and 12 h（scale bar=20 μm）；C：EP elevated the relative luciferase activity in?duced by ARE；D-1：the expression of HO-1 after treatment with 100 μmol/L glutamate（Glu）for 0，3，6，12 and 24 h；D-2：the expression of HO-1 after treatment with 2.5 mmol/L EP for 0，3，6 and 12 h；D-3：the expression of HO-1 after treatment with 2.5 mmol/L EP+100 μmol/L Glu for 1，3 and 6 h；E：ZnPP partly inhibited the protective effect of EP against Glu excitotoxicity.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Glu group；△P＜0.05 vs Glu+EP group.圖4 大鼠小腦顆粒神經(jīng)元內(nèi)Nrf2/ARE/HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果