謝開紅，梁家健，蔡大霞，安姿旖，劉革修，胡小毛△

（1湘南學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，湖南郴州 423000；2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所，廣東廣州 510632）

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，以來源于腎小管上皮的透明細胞癌占絕大多數(shù)，治療效果差，是導(dǎo)致患者死亡的主要類型［1］。針對其VHL抑癌基因失活導(dǎo)致的低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血小板衍生生長因子（platelet-de?rived growth factor，PDGF）過表達的特性，目前腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）的治療采用了靶向VEGF 信號軸的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI），包括索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼、阿昔替尼、樂伐替尼和卡博替尼［2］。但是在這些藥物的臨床應(yīng)用中觀察到原發(fā)性和獲得性耐藥情況，所以需要尋找新的替代藥物。達沙替尼（dasatinib）是最早被使用的一種TKI，主要用于慢性髓系白血病的治療。后來在一些實體瘤臨床試驗中觀察到達沙替尼也有一定的效果，包括腦膠質(zhì)瘤、肺癌、卵巢癌和前列腺癌等［3］。相較于目前臨床使用的其他酪氨酸激酶抑制劑，達沙替尼抑制的激酶種類更為多樣，包括SRC、SFKs、BCR-ABL、c-KIT、PDGFR、c-FMS 和EPHA2。在上述實體瘤中已經(jīng)證實，達沙替尼除了抗血管生成外，還可抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程［4］。因此，達沙替尼可能是治療腎癌的一種新的可替代藥物。本項工作探討達沙替尼體外對人腎透明細胞癌細胞株786-O 及769-P 活力、凋亡及遷移的影響，為達沙替尼治療腎癌提供參考資料。

材料和方法

1 細胞

人腎癌細胞株786-O 及769-P 購自中國科學(xué)院上海細胞庫，于含1%青霉素-鏈霉素雙抗及10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

2 主要試劑

以二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO；購于MP Biomedicals）為溶劑，制成20 mmol/L 的達沙替尼（購于APExBIO）用于體外實驗。RPMI-1640 完全培養(yǎng)液（HyClone）；胎牛血清（Gibco）；MTT 試劑盒（Dojindo）；細胞周期試劑盒（南京凱基公司）；Hoechst 33258 染色液（Solar）；RIPA 細胞裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Thermo）；兔抗人cleaved caspased-3（cl-caspase-3）單抗、兔抗人cleaved caspased-9（cl-caspase-9）單抗、兔抗人p-AKT 單抗、鼠抗人細胞周期蛋白D1（cyclin D1）單抗、鼠抗人p21 單抗、鼠抗人p53 單抗、鼠抗人GAPDH 單抗以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG（Cell Signaling Technology）。

3 主要儀器

DNM-9602G自動酶標(biāo)儀購自北京普朗新技術(shù)有限公司；FACSCalibur 流式細胞儀購自BD；Heal?ForeNeofuge13臺式高速冷凍離心機購自上海力申科學(xué)儀器有限公司；PAC1000 型蛋白電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自Bio-Rad；Meta-Morph 凝膠成像分析系統(tǒng)購自Media Cybernetics。

4 主要方法

4.1 MTT 法檢測細胞活力 將對數(shù)期的786-O 細胞及769-P 細胞分別接種于96 孔板中（每孔3 000個），每孔100 μL，復(fù)孔3 個。在CO2培養(yǎng)箱中于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液里培養(yǎng)12 h 后加入達沙替尼，依據(jù)達沙替尼體外作用腫瘤細胞系的報道［5］，以及前期預(yù)實驗確定實驗濃度，使其終濃度分別為0 μmol/L、0.015 6 μmol/L、0.031 3 μmol/L、0.062 5 μmol/L、0.125 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L 和2 μmol/L，同時設(shè)置調(diào)零孔（RPMI-1640 培養(yǎng)液+0.1%DMSO）和空白對照孔（細胞、0.1%DMSO和RPMI-1640培養(yǎng)液）。在含5%CO2和飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加MTT 溶液（5 g/L，用PBS 配制，pH=7.4）10 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液后每孔加100 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解，選擇570 nm波長在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔吸光度（A）值。將獨立重復(fù)3 次的數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad Prism 8.2.1 作折線圖［6］。對后面涉及的細胞周期和凋亡相關(guān)實驗，以生長曲線中達沙替尼最低有效濃度以及IC50為參照設(shè)置藥物濃度（0.5 和1 μmol/L）。細胞遷移實驗中，為降低達沙替尼對細胞活力的抑制作用，采用較低濃度（0～0.031 3 μmol/L）進行實驗。

4.2 劃痕實驗檢測達沙替尼對細胞遷移能力的影響 將對數(shù)期的786-O及769-P細胞分別接種于6孔板中（每孔50 000 個），待細胞在血清含量為10%的RPMI-1640 培養(yǎng)液中貼壁并長至融合時，使用200 μL 吸頭在6 孔板中間均勻地劃1 條直線后用PBS 輕洗去漂懸的細胞，加入達沙替尼和含2%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，使達沙替尼終濃度分別為0 μmol/L、0.007 8 μmol/L、0.015 6 μmol/L 和0.031 3 μmol/L，分別在加藥后0、6、12 和24 h 時在倒置顯微鏡（Leica）下觀察拍照，然后使用Image-Pro Plus 軟件分析照片，測量劃痕位置的面積和高度，將面積除以高度可以得到平均的劃痕寬度，將0 h的劃痕寬度減去實驗結(jié)束時的劃痕的寬度，得到的就是細胞遷移的距離，以細胞遷移距離計算細胞遷移能力。將3次獨立重復(fù)的數(shù)據(jù)分析后進行統(tǒng)計分析并繪制柱狀圖［6］。

4.3 PI 單染法檢測達沙替尼對細胞周期的影響將對數(shù)期的786-O 及的769-P 細胞分別以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液置于25T培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，當(dāng)細胞長至60%～70%融合時加入達沙替尼，使其終濃度分別為0、0.02、0.1 和0.5 μmol/L；在含5% CO2且飽和濕度的37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，200×g離心5 min收集所有的細胞，PBS重懸后離心（200×g，5 min）去上清，加入600 μL PBS 重懸細胞后逐滴加入1 400 μL無水乙醇，?20℃固定過夜后離心去上清（200×g，5 min），PBS 重懸后離心（200×g，5 min）、加入RNase（工作濃度20 mg/L），37℃孵育30 min 后離心去上清（200×g，5 min），加入PI（工作濃度50 mg/L），室溫避光孵育30 min，最后過300目篩后上流式細胞儀（ACEA）檢測［6］。

4.4 Hoechst 33258 染色檢測達沙替尼對細胞凋亡的影響 將對數(shù)期的786-O 及769-P 細胞分別接種6孔板中（每孔50 000 個），在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，當(dāng)細胞長至60%～70%融合時加入達沙替尼，終濃度分別為0 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L 和2 μmol/L；在含5% CO2且飽和濕度的37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，離心收集所有細胞，加入0.5 mL 固定液懸起細胞后室溫固定10 min，離心去固定液，用PBS 洗2遍，每次3 min。離心后吸去大部分液體保留50 μL液體，輕輕混勻細胞后滴加至載玻片上。均勻滴上0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min。用PBS 洗2 遍，每次3 min，滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上蓋玻片。接著于熒光顯微鏡中的DAPI 通道中觀察拍照，正常細胞，胞核呈光滑圓形，胞核染色較均一；凋亡細胞，胞核碎片化，因DNA 濃縮致密而深染（藍色發(fā)白）；壞死細胞，胞核邊緣不清晰，DNA 不濃縮；正在分裂的細胞，因DNA 濃縮致密而深染，但顯著可見兩組DNA 分列兩排。計數(shù)總細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù)，計算兩者比例，將3 次獨立重復(fù)的數(shù)據(jù)都分析完后進行統(tǒng)計分析并繪制柱狀圖［6］。

4.5 Western blot 檢測細胞周期及細胞凋亡相關(guān)蛋白水平 對數(shù)期786-O 及769-P 細胞以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液置于25T培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，當(dāng)細胞長至60%～70%融合時加入達沙替尼，終濃度為0 μmol/L、0.5 μmol/L 和1 μmol/L。在5%CO2且飽和濕度的37℃、細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后收集所有的細胞，冰上RIPA 裂解液裂解細胞提取總蛋白后，BCA 法測定蛋白濃度，接著以每孔上樣40 μg蛋白量進行蛋白電泳（恒壓，先70 mV 持續(xù)30 min，后110 mV 持續(xù)90 min），待蛋白跑至分離膠底層后以濕轉(zhuǎn)法（恒流220 mA，持續(xù)2 h）轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，TBS 洗膜5 min，4℃孵Ⅰ抗12 h，TBS 洗膜（3 次，每次10 min）室溫下振蕩孵Ⅱ抗1 h，TBS 洗膜（3 次，每次10 min），最后條帶ECL 化學(xué)發(fā)光后在全自動化學(xué)發(fā)光和熒光凝膠成像系統(tǒng)（UVITEC）中顯影拍照，并用Gel-Pro Analyzer 6.0 軟件對照片進行分析，將目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參蛋白的灰度值，進行歸一化處理［6］。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 8.2.1 進行統(tǒng)計分析和作圖，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，在各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義的基礎(chǔ)上再進行兩兩比較的t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 達沙替尼抑制786-O及769-P細胞活力

用梯度濃度的達沙替尼處理24 h 后，786-O 及769-P的細胞活力出現(xiàn)不同程度的抑制（圖1）。隨著達沙替尼濃度的增大（0.015 6～2 μmol/L），786-O 及769-P 細胞活力逐漸降低，其中達沙替尼對786-O 及769-P 細胞株的IC50分別為（0.9587±0.0288）μmol/L和（0.7843±0.0660）μmol/L。

Figure 1.Dasatinib inhibited the viability of 786-O and 769-P cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L group.圖1 達沙替尼對786-O及769-P細胞活力的抑制作用

2 達沙替尼抑制786-O及769-P細胞遷移

786-O 及769-P 細胞進行劃痕實驗，觀察達沙替尼對細胞遷移能力的影響。0 μmol/L 的dasatinib 組24 h 時細胞已基本融合，實驗組細胞則有不同程度的空白區(qū)，表明達沙替尼對786-O 及769-P 細胞的遷移有抑制作用（P＜0.05），并隨著達沙替尼濃度的增加，抑制遷移的作用越顯著，呈濃度依賴性（P＜0.05或P＜0.01），見圖2、3。

Figure 2.Dasatinib blocked the migration ability of 786-O cells.The migration ability of 786-O cells was detected by wound healing method（scale bar=300 μm）.The distance of migratory cells was normalized to the value of 0 h group.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 μmol/L group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 0.0078 μmol/L group；△P＜0.05 vs 0.0156 μmol/L group.圖2 達沙替尼阻滯786-O細胞遷移

Figure 3.Dasatinib blocked the migration ability of 769-P cells.The migration ability of 769-P cells was detected by wound healing method（scale bar=300 μm）.The distance of migratory cells was normalized to the value of 0 h group.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 μmol/L group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 0.0078 μmol/L group；△P＜0.05 vs 0.0156 μmol/L group.圖3 達沙替尼阻滯769-P細胞遷移

3 達沙替尼阻滯786-O及769-P細胞周期

達沙替尼處理24 h 后，與0 μmol/L dasatinib 組相比，各實驗組處于G1期的細胞比例均有增加（P＜0.05），且隨著達沙替尼濃度的增加，G1期的細胞比例也增加（P＜0.05），相應(yīng)的S期的細胞比例減小（P＜0.05）；兩細胞系的G2期細胞變化略有差異，處于G2期的786-O 細胞比例無顯著變化（P＞0.05），而處于G2期的769-P 細胞比例總體減小（P＜0.05），見圖4、5。

Figure 4.Dasatinib induced cell cycle arrest of 786-O cells.Propidium iodide（PI）staining method was used to detected the cell cy?cle（A）and the data was showed with a statistical histogram（B）.D0：0 μmol/L dasatinib；D0.02：0.02 μmol/L da?satinib；D0.1：0.1 μmol/L dasatinib；D0.5：0.5 μmol/L dasatinib.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 μmol/L group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 0.02 μmol/L group.圖4 達沙替尼誘導(dǎo)786-O細胞周期阻滯

Figure 5.Dasatinib induced cell cycle arrest of 769-P cells.Propidium iodide（PI）staining method was used to detected the cell cy?cle（A）and the data was showed with a statistical histogram（B）.D0：0 μmol/L dasatinib；D0.02：0.02 μmol/L da?satinib；D0.1：0.1 μmol/L dasatinib；D0.5：0.5 μmol/L dasatinib.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 μmol/L group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 0.02 μmol/L group.圖5 達沙替尼誘導(dǎo)769-P細胞周期阻滯

4 達沙替尼促進786-O及769-P凋亡

達沙替尼處理24 h后，進行Hoechst 33258染色，從圖6A 可以看出對照組絕大部分細胞胞核呈光滑圓形，胞核染色較均一，為正常細胞；各實驗組可見不同比例的凋亡細胞，即胞核碎片化，因DNA 濃縮致密而深染（藍色發(fā)白），并隨著達沙替尼濃度的增大，凋亡細胞的比例逐漸增大（P＜0.01），見圖6B。

5 達沙替尼對786-O 及769-P 細胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的影響

達沙替尼處理24 h 后，各實驗組凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9 的蛋白表達量相對于對照組顯著增加（P＜0.01）；同時，cyclin D1的表達量均較對照組下降（P＜0.01），周期相關(guān)通路蛋白p53和p21表達量均較對照組增加（P＜0.01），p-AKT水平則較對照組減少（P＜0.01），見圖7、8。

Figure 6.Dasatinib promoted the apoptosis of 786-O cells and 769-P cells in vitro.Hoechst 33258 staining was used to detected the apoptosis（A，scale bar=100 μm）and the data was showed with a statistical histogram（B）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 μmol/L group；##P＜0.01 vs 0.5 μmol/L group；△△P＜0.01 vs 1 μmol/L group.圖6 達沙替尼在體外促進786-O和769-P細胞凋亡

討 論

本研究結(jié)果顯示達沙替尼在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性地抑制腎癌細胞株786-O 和769-P 的活力與遷移，并誘導(dǎo)凋亡，該結(jié)果提示了達沙替尼在治療腎癌方面存在深入研究意義。本研究進一步分析顯示，達沙替尼作用于腎癌細胞株786-O 和769-P 的機制與降低AKT 的磷酸化水平、上調(diào)cleaved caspase-3和cleaved caspase-9 蛋白水平有關(guān)。已有研究資料顯示，在腎細胞癌中存在突變的VHL以及異?；罨腣EGF 和PDGF 等，它們則導(dǎo)致細胞生長與存活關(guān)聯(lián)蛋白AKT 活性異常增加，促進瘤細胞發(fā)生發(fā)展［7］。而且RCC 中VHL-HIF 和PI3K-AKT 信號通路緊密相連：VHL缺失而引起的HIF上調(diào)促進了多種生長因子的表達，包括EGF，PDGF 和VEGF［8］，這些因子則通過受體酪氨酸激酶途徑激活PI3K/AKT 信號，再激活mTORC1 和mTORC2 會促進HIF 表達［9］，形成正反饋回路，促進RCC 的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果不僅與上述研究資料相呼應(yīng)，而且也進一步印證了達沙替尼的藥理作用，如研究報道其通過抑制SRC 影響PI3KAKT 和Ras-MAPK 途徑，誘導(dǎo)鼻咽癌細胞凋亡［10］。已有資料報道，PI3K 信號通路抑制劑對于PI3K-AKT通路被高度激活的RCC 顯示出有益的臨床效果［11］。所以，本研究結(jié)果提示達沙替尼可通過抑制PI3KAKT信號通路發(fā)揮抗腎癌細胞潛力。

由于達沙替尼是多種激酶的TKI 藥物，本研究也探討了其它作用途徑。p53 功能的喪失是腎細胞癌發(fā)展的關(guān)鍵事件，與細胞周期和腫瘤細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)［12］。本研究結(jié)果檢測到達沙替尼可使腎癌細胞胞內(nèi)p53 和p21 表達量增加，進而下調(diào)cyclin D1 的表達，使腎癌細胞周期阻滯于G1期，抑制腎癌細胞增殖，該結(jié)果證實了其可以通過p53 途徑影響細胞周期、抑制細胞生長，說明其藥理作用的多樣性，同時提示其某些特殊情況的應(yīng)用前景。已有臨床研究表明，達沙替尼在體內(nèi)可降低腎癌患者血清VEGF 的水平，說明其具有抑制癌內(nèi)血管生長作用［13］。此外，在犬模型的研究中顯示，達沙替尼通過抑制c-SRC并增強Wnt 和HER 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而阻滯乳癌細胞的遷移和轉(zhuǎn)移［14］。本研究體外實驗結(jié)果也證實達沙替尼可阻滯786-O 和769-P 細胞的遷移，提示達沙替尼抑制腎癌細胞轉(zhuǎn)移的可能性。

Figure 7.The effect of dasatinib on the levels of cell cycle-related（A）and apoptosis-related（B）proteins in 786-O cells.The electro?phoresis strips′ gray scale values were showed with a histogram（C）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 μmol/L group；##P＜0.01 vs 0.5 μmol/L group.圖7 達沙替尼對786-O細胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

Figure 8.The effect of dasatinib on the levels of cell cycle-related（A）and apoptosis-related（B）proteins in 769-P cells.The electro?phoresis strips′ gray scale values were showed with a histogram（C）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 μmol/L group；##P＜0.01 vs 0.5 μmol/L group.圖8 達沙替尼對769-P細胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

達沙替尼最初用于血液髓系腫瘤的治療，目前逐步用于部分實體瘤的治療［15］。本研究則在體外細胞水平觀察了達沙替尼抑制腎癌細胞活力與遷移，提示了其治療腎癌應(yīng)用的可能性。但是需要進一步的體內(nèi)實驗和臨床試驗才能驗證其治療腎癌的有效性和可行性。