張 瓊，萬(wàn)昌武，于燕妮，夏 冰，劉江金，張橋軍，李 竹，王承飛，戴佳琳，王 杰

（貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550001）

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary athero?sclerotic heart disease，CHD）簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病，是一種受多種復(fù)雜因素影響的慢性炎癥性疾病，其主要特征是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，內(nèi)膜增厚，管腔不同程度狹窄，心肌缺血、缺氧，從而引起心臟結(jié)構(gòu)和功能的紊亂。目前冠心病已成為全球首要的死亡和致殘病因［1-2］，其病死率高達(dá)心血管疾病總死亡率的80%［3］，已經(jīng)嚴(yán)重危害到人類(lèi)的身心及精神健康。

組織蛋白酶（cathepsin）是在溶酶體中廣泛表達(dá)的一大類(lèi)水解蛋白酶，目前已發(fā)現(xiàn)20 余種，人類(lèi)組織蛋白酶共有11 種（組織蛋白酶B、C、F、H、K、L、O、S、V、W 和X）［4］，其中，組織蛋白酶C（cathepsin C，CTSC），也稱(chēng)為二肽基肽酶I（dipeptidyl peptidase I，DPPI），屬于半胱氨酸類(lèi)別的組織蛋白酶，主要在髓細(xì)胞、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞及其前體細(xì)胞等免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)［5-7］，其主要的生理功能是通過(guò)激活促炎性顆粒相關(guān)絲氨酸蛋白酶而促進(jìn)炎癥反應(yīng)［8］。2015年，Herías等［9］首次提出CTSC 與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系，在人頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中檢測(cè)到CTSC 的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。另外，在其小鼠模型中，造血細(xì)胞中CTSC 的缺乏可緩解動(dòng)脈粥樣硬化病變的形成進(jìn)程。同屬半胱氨酸家族的組織蛋白酶S、K 和L 等［10-12］在動(dòng)脈粥樣硬化疾病等心血管疾病中的研究已相對(duì)比較成熟［13］，然而CTSC 在人心血管疾病尤其是在冠心病中的研究目前較為少見(jiàn)。

腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNFα）是由活化的單核巨噬胞分泌的一種炎癥細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)人體免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，其血清水平可能反映人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的嚴(yán)重程度和穩(wěn)定性［14］。在劉清霞等［15］的研究中，TNF-α 的陽(yáng)性表達(dá)隨斑塊不穩(wěn)定性增加而增強(qiáng)。目前尚未見(jiàn)到關(guān)于CTSC 和TNF-α 在冠心病中的相關(guān)性研究，因此本研究將檢測(cè)人冠狀動(dòng)脈組織中CTSC 和TNF-α 的表達(dá)，分析兩者之間的關(guān)系并探討兩者在冠心病中的可能作用，以期為冠心病的預(yù)防和治療提供參考資料。

材料和方法

1 研究對(duì)象

收集貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)司法鑒定中心2018 年10 月～2019 年12 月的冠心病死亡案例52 例和無(wú)任何心血管疾病的意外死亡案例25 例。嚴(yán)格按照以下納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)：冠心病組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）尸體常溫保存不超過(guò)24 h 或冷凍保存不超過(guò)3 d，室溫解凍24 h；（2）冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜粥樣斑塊形成；（3）病理組織學(xué)確診為冠心病的死者；對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）尸體常溫保存不超過(guò)24 h 或冷凍保存不超過(guò)3 d，室溫解凍24 h；（2）高墜、交通事故和電擊等意外事故造成的死亡；（3）病理組織學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)任何心臟疾病及冠脈狹窄。對(duì)照組和冠心病組排除標(biāo)準(zhǔn)：組織自溶、腐??；病理組織學(xué)檢查顯示有高血壓性心臟病、肥厚性心肌病等其他心臟疾病死亡案例。本研究所有案例經(jīng)過(guò)貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)認(rèn)可（批件號(hào)：2018-60-01），并有家屬簽署知情同意書(shū)。

收集的冠狀動(dòng)脈組織均用液氮保存，用冰的PBS 洗凈后取斑塊最明顯且血管內(nèi)膜最厚的部位將每段冠狀動(dòng)脈組織剪成80～100 g 的若干小段，液氮速凍后立即放入?80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 主要試劑和儀器

CTSC 多克隆抗體（Abcam）；TNF-α 多克隆抗體（Immunoway）；PV-6000 兔/鼠超敏二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑和DAB 顯色試劑盒（中杉金橋公司）；鼠抗人β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（Abbkine）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天生物技術(shù)）。

3 方法

3.1 冠狀動(dòng)脈組織學(xué)形態(tài)觀察與分析 所收集的冠狀動(dòng)脈組織用4%中性甲醛液固定1 周后進(jìn)行石蠟包埋、切片（4 μm）并制片，蘇木素-伊紅（HE）染色后中性樹(shù)脂封片，用EasyScan 數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)（中國(guó)麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）掃描，并對(duì)其進(jìn)行采圖，用Image-Pro Plus 6.0 測(cè)量冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜厚度和纖維帽厚度，并計(jì)算管腔狹窄程度。

3.2 Western blot 法檢測(cè)CTSC 和TNF-α 的蛋白表達(dá) ?80℃冰箱取出備好的實(shí)驗(yàn)樣本，加液氮研成粉末勻漿，低溫離心機(jī)4℃、13 225×g提取蛋白上清液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量蛋白濃度，10%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，PBS搖床清洗3次，每次5 min，孵育Ⅰ抗［β-actin 和TNF-α 抗體（1∶2 000），CTSC 抗體（1∶1 000）］，4℃冰箱過(guò)夜，回收Ⅰ抗，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1∶5 000），孵育1 h后經(jīng)Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)顯色成像，用ImageJ 分析軟件測(cè)量各條帶的灰度值并進(jìn)行分析。每組數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果。

3.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)CTSC 和TNF-α 的表達(dá)與細(xì)胞定位 4%中性甲醛固定新鮮冠狀動(dòng)脈組織，石蠟包埋并切片（4 μm），60℃烤箱烤片1.5 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水合后滴加3%過(guò)氧化氫封閉抗原，高壓修復(fù)抗原3 min，孵育Ⅰ抗［CTSC 和TNF-α抗體（1∶100）］，滴加PBS 緩沖液作陰性對(duì)照，4℃冰箱孵育過(guò)夜，室溫孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠/兔IgG，滴加DAB 顯色液，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，在光學(xué)顯微鏡下觀察CTSC 和TNF-α 的陽(yáng)性表達(dá)。陽(yáng)性染色定位：排除非特異性染色及邊緣效應(yīng)后，光鏡下組織以黃色、棕黃色和棕褐色為陽(yáng)性表達(dá)，并觀察陽(yáng)性染色在細(xì)胞內(nèi)的定位和分布特點(diǎn)。400 倍鏡下采集圖片，Image-Pro Plus 6.0 圖像處理軟件測(cè)量所染組織切片陽(yáng)性表達(dá)的總面積和總吸光度，并根據(jù)公式計(jì)算平均吸光度。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)。指標(biāo)間相關(guān)性分析采用Pearson 積矩相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 案例基本資料

本研究收集到因冠心病死亡者52 例，其中男性32 例，女性20 例，年齡32～70 歲，平均年齡（56.9±9.7）歲；因意外事故（如高墜、電擊、交通事故等）造成死亡25 例，其中男性15 例，女性10 例，年齡25～59歲，平均年齡（42.3±8.9）歲。

2 冠狀動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)分析

對(duì)照組冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜完整、無(wú)增厚，無(wú)泡沫細(xì)胞堆積，管腔未見(jiàn)狹窄，血管平滑肌細(xì)胞排列整齊，中膜未見(jiàn)受壓變薄現(xiàn)象；與對(duì)照組相比，冠心病組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，內(nèi)膜不規(guī)則增厚，內(nèi)膜下可見(jiàn)大量泡沫細(xì)胞堆積形成較大的脂質(zhì)池，纖維帽結(jié)構(gòu)明顯，中膜明顯受壓變薄，血管腔呈不同程度偏心性狹窄，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Histomorphological changes of the coronary artery tis?sues（HE staining，scale bar=300 μm）.A：control group；B：CHD group.圖1 冠狀動(dòng)脈的組織形態(tài)學(xué)變化

對(duì)兩組樣本的形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量分析，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，冠心病組內(nèi)膜厚度增加，纖維帽變厚，管腔明顯狹窄（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 冠狀動(dòng)脈形態(tài)學(xué)指標(biāo)的比較Table 1.Comparison of morphological indexes of coronary artery lesion（Mean±SD）

3 冠狀動(dòng)脈組織中CTSC和TNF-α蛋白表達(dá)水平

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，冠心病組中CTSC 和TNF-α 的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

4 冠狀動(dòng)脈組織中CTSC 和TNF-α 蛋白的細(xì)胞定位和吸光度的變化情況

對(duì)照組未見(jiàn)CTSC 和TNF-α 陽(yáng)性表達(dá)，冠心病組CTSC 和TNF-α 陽(yáng)性表達(dá)均主要在泡沫細(xì)胞胞質(zhì)中，陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色，見(jiàn)圖3。

用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析檢測(cè)血管內(nèi)CTSC 和TNF-α 蛋白表達(dá)的平均吸光度，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，冠心病組CTSC 和TNF-α 陽(yáng)性表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05），見(jiàn)表2。

5 CTSC和TNF-α的相關(guān)性分析

用Pearson 積矩相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)法對(duì)所測(cè)量的CTSC 和TNF-α 的平均吸光度進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，冠心病組CTSC 和TNF-α 的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)關(guān)系（r2=0.743，P＜0.05），見(jiàn)圖4。

Figure 2.The protein expression levels of CTSC and TNF-α were detected by Western blot.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group.圖2 CTSC和TNF-α的蛋白表達(dá)情況

Figure 3.The expression of CTSC and TNF-α in coronary atherosclerotic lesions（immunohistochemical staining，scale bar=50 μm）.A，D：control group；B，C，E，F(xiàn)：CHD group.圖3 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病灶內(nèi)CTSC和TNF-α的表達(dá)

表2 冠狀動(dòng)脈病變中CTSC和TNF-α蛋白表達(dá)的平均吸光度Table 2.Mean absorbance of the expression of CTSC and TNF-α proteins in coronary artery lesions（Mean±SD）

討 論

冠心病是一種發(fā)病率和死亡率較高的心血管疾病［16］，其主要病理特征是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。識(shí)別更多的生物標(biāo)志物，對(duì)于了解冠心病的發(fā)生發(fā)展及診斷治療具有重要意義。本課題組在前期針對(duì)一組冠心病案例的冠狀動(dòng)脈組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析，識(shí)別了256 個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中組織蛋白酶家族成員在核心網(wǎng)絡(luò)中具有關(guān)鍵作用。組織蛋白酶家族多數(shù)成員參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展［17］，但是關(guān)于CTSC 與人冠心病冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的報(bào)道較少。CTSC 作為組織蛋白酶家族成員之一也是差異表達(dá)蛋白，相較于正常組，其表達(dá)量顯著升高，提示CTSC 在冠心病的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮著一定的作用。CTSC 是一種較保守的四聚體半胱氨酸類(lèi)蛋白酶，其主要作用是降解細(xì)胞內(nèi)不需要的蛋白質(zhì)以及激活免疫和炎癥細(xì)胞內(nèi)絲氨酸蛋白酶［18］。CTSC 在多種疾病中發(fā)揮作用，如常染色體隱性遺傳性疾病Papillon-Lefèvre 綜合征中CTSC基因位點(diǎn)的突變［19］、神經(jīng)炎癥的反應(yīng)進(jìn)程［20］、多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等［21］。近年來(lái)的研究顯示在動(dòng)脈粥樣硬化的血管內(nèi)存在CTSC 表達(dá)異常［9，22］，并促進(jìn)斑塊的形成，如在小鼠模型中，CTSC 的缺陷能夠減緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)程［22］，提示CTSC 可能參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。但以上研究主要局限于人頸動(dòng)脈及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，因此本研究進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)生粥樣硬化的冠狀動(dòng)脈CTSC 表達(dá)水平，結(jié)果顯示粥樣硬化冠狀動(dòng)脈組CTSC 表達(dá)顯著升高，且CTSC 陽(yáng)性表達(dá)主要分布在泡沫細(xì)胞，提示冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病灶內(nèi)存在CTSC 表達(dá)異常并與泡沫細(xì)胞的形成有關(guān)，推測(cè)CTSC 在冠心病動(dòng)脈粥樣硬化中表達(dá)升高可能會(huì)影響斑塊的形成及其穩(wěn)定性。一項(xiàng)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究顯示，CTSC 通過(guò)激活蛋白激酶C/p38-MAPK/NF-κB 信號(hào)通路誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向M1極化，導(dǎo)致炎癥因子釋放增加，從而促進(jìn)神經(jīng)炎癥的發(fā)展［20］。Alam 等［23］的一項(xiàng)研究也顯示CTSC 在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)且可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M1極化，增加炎癥因子的釋放，從而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。

Figure 4.Correlation scatter diagram between CTSC and TNFα.The horizontal and vertical axes represent the mean absorbance（MA）of CTSC and TNF-α，respec?tively.圖4 CTSC和TNF-α的相關(guān)性散點(diǎn)圖

Zhang 等［24］的一項(xiàng)研究顯示，作為CTSC 的下游因子，TNF-α 表達(dá)量隨CTSC 的增加而增加，即CTSC和TNF-α/MAPK（p38）信號(hào)之間可能存在正反饋回路，CTSC 可通過(guò)該途徑增加肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。TNF-α 是主要由單核巨噬細(xì)胞分泌的一種炎癥因子，可介導(dǎo)體內(nèi)的免疫及炎癥反應(yīng)［25］，有研究顯示在動(dòng)脈粥樣硬化中，TNF-α 表達(dá)上調(diào)，尤其在不穩(wěn)定性斑塊組表達(dá)上調(diào)更明顯［14-15］，本研究檢測(cè)粥樣硬化冠狀動(dòng)脈TNF-α 水平，同樣顯示動(dòng)脈粥樣硬化病灶內(nèi)TNF-α 水平高于對(duì)照組。另外，我們通過(guò)分析顯示CTSC 和TNF-α 之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，TNF-α能刺激炎癥因子的生成，直接發(fā)揮促炎作用［26］，其在動(dòng)脈粥樣硬化病灶內(nèi)的高表達(dá)可能刺激炎癥細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致壞死灶擴(kuò)大，斑塊結(jié)構(gòu)破壞等，從而影響斑塊的穩(wěn)定性，甚至導(dǎo)致急性心血管事件的發(fā)生。我們推測(cè)TNF-α 可能激活CTSC 表達(dá)，而CTSC 表達(dá)上調(diào)可通過(guò)激活蛋白激酶C/p38 MAPK/NF-κB 信號(hào)通路誘導(dǎo)促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1 極化［20］，增加炎癥因子的釋放，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致冠心病動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。

綜上所述，CTSC 和TNF-α 在粥樣硬化冠狀血管組織中的高表達(dá)提示CTSC 和TNF-α 兩者的協(xié)同作用可能促進(jìn)粥樣硬化病灶內(nèi)的炎癥反應(yīng)，并與粥樣硬化病灶的穩(wěn)定性下降有關(guān)。本研究直接檢測(cè)人體冠脈組織CTSC 和TNF-α 水平，彌補(bǔ)了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與人類(lèi)種屬差異性的缺陷，但作為一項(xiàng)橫斷面研究，未探討其內(nèi)在作用機(jī)制，因此關(guān)于粥樣硬化病灶內(nèi)CTSC作用的病理生理機(jī)制有待下一步更深入的研究。