衛(wèi) 陽(yáng),金迎迎,梁越進(jìn),邢 燕,4
恙蟲病東方體(Orientiatsutsugamushi)是引起恙蟲病的病原微生物,是一種脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)缺乏的革蘭氏陰性菌,專性細(xì)胞內(nèi)生存并可在感染的內(nèi)皮細(xì)胞中自由復(fù)制[3]。位于組織和循環(huán)系統(tǒng)之間的內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cell,EC)層是炎癥細(xì)胞運(yùn)轉(zhuǎn)的關(guān)鍵界面,內(nèi)皮細(xì)胞間連接和血管泄漏密切相關(guān)。血管滲透性過高是急性炎癥最重要的特征,細(xì)胞及體液免疫效應(yīng)因子可利用血管泄漏進(jìn)入感染或受損位置,引起宿主器官功能紊亂及休克等不良后果[4-5]。Tie2是一種跨膜內(nèi)皮細(xì)胞酪氨酸激酶受體,是細(xì)胞間連接的一個(gè)重要分子,可調(diào)控血管形成及內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和通透性。血管生成素(Angiopoietin, Ang)1和2是重要的Tie2的配體[6]。Ang1由內(nèi)皮旁細(xì)胞產(chǎn)生,起激動(dòng)作用,結(jié)合Tie2使其磷酸化,并通過Akt/Foxo1通路以維持血管完整性,抑制血管的泄漏、炎癥因子的表達(dá)以及白細(xì)胞的招募和轉(zhuǎn)移的作用;Ang2由內(nèi)皮細(xì)胞自身產(chǎn)生,與Ang1競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合Tie2而對(duì)Tie2磷酸化起抑制作用,導(dǎo)致?lián)p傷和血管泄漏[7]。然而,有研究顯示在無(wú)菌條件下,Ang2對(duì)Tie2信號(hào)有激活作用[8]。恙蟲病東方體感染對(duì)宿主內(nèi)皮細(xì)胞Tie2/Akt/Foxo1信號(hào)通路的具體影響尚不清楚。
本研究通過動(dòng)物及內(nèi)皮細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn),檢測(cè)Tie2/Akt/Foxo1信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和磷酸化水平、炎癥因子和細(xì)胞通透相關(guān)蛋白的表達(dá),以分析在恙蟲病東方體感染宿主過程中,Tie2信號(hào)的變化及影響,為恙蟲病的防治提供理論依據(jù)。
1.1細(xì)菌培養(yǎng)及分離 恙蟲病東方體Karp株(OrientiatsutsugamushiKarpstrain,OtK)在 Vero E6 細(xì)胞(猴腎細(xì)胞系)中培養(yǎng)增殖。該實(shí)驗(yàn)在UTMB加爾維斯頓國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室(ABSL3 facility)進(jìn)行。34 ℃輕搖2 h,再加入含有1% 胎牛血清(FBS)和1% HEPES 緩沖液的DMEM(Gibco)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通常在14~21 d,細(xì)胞變圓或有細(xì)胞浮起區(qū)域遍布培養(yǎng)瓶時(shí),涂片用Dif-Quik(Fisher Scientific, Kalamazoo, MI)評(píng)估感染程度。當(dāng)有80%-90%的細(xì)胞被感染,將這些細(xì)菌再次接種到新鮮的單層Vero細(xì)胞上。重復(fù)6遍后,收集細(xì)胞懸液,4 ℃,22 000×g 離心 45 min。將細(xì)胞沉淀在蔗糖磷酸-谷氨酸鹽(sucrosephosphate-glutamate,SPG)緩沖液中重懸,再轉(zhuǎn)移至50 mL含有5 mL無(wú)菌玻璃珠的錐形管中輕柔蝸旋,使釋放細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。700×g 離心收集含有細(xì)菌的上清液,22 000×g離心45 min,即得到無(wú)細(xì)胞的細(xì)菌沉淀。將細(xì)菌在SPG緩沖液中重懸,存于-80 °C。用于感染動(dòng)物或細(xì)胞。
1.2斑點(diǎn)形成實(shí)驗(yàn)(Focus forming assays,F(xiàn)FA) 斑點(diǎn)形成實(shí)驗(yàn)對(duì)OtK活細(xì)菌數(shù)定量[9]。含1% FBS 和1% HEPES的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)Vero E6細(xì)胞過夜,待細(xì)胞長(zhǎng)匯合后,將連續(xù)10倍稀釋的OtK菌液(200 μL)種到該細(xì)胞單層上。培養(yǎng)2 h后,用熱的含鈣和鎂的Dulbecco’s PBS緩沖液洗培養(yǎng)板以移走細(xì)胞外死細(xì)菌。再加含1% FBS、0.5% 甲基纖維素和環(huán)十二碳三烯的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基到孔板上,在34 ℃培養(yǎng)5 d后,用甲醇4 ℃固定細(xì)胞。用含1% BSA的PBS室溫下封閉培養(yǎng)孔30 min。加多克隆兔抗鼠OtK,室溫孵育30 min。再加Alexa-594 山羊抗兔IgG(Invitrogen, Carlsbad CA)孵育30 min。倒置熒光顯微鏡下檢測(cè)。取10~100個(gè)斑點(diǎn)的OtK感染孔計(jì)數(shù),計(jì)算斑點(diǎn)形成單位的濃度定量活菌數(shù)。
1.3動(dòng)物感染 C57BL/6J野生雌鼠購(gòu)買自Jackson實(shí)驗(yàn)室,在無(wú)特定病原菌條件下飼養(yǎng)。根據(jù)美國(guó)德克薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)分部動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)。所有小鼠感染研究均在UTMB加爾維斯頓國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室(ABSL3 facility)進(jìn)行;所有組織處理和分析實(shí)驗(yàn)在生物安全3級(jí)或2級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。8~12周齡C57BL/6J小鼠經(jīng)尾靜脈注射致死量OtK(4.5×106FFU in 200 mL),對(duì)照小鼠注射PBS。感染后第2、6、10 d,收集組織樣本,立即對(duì)細(xì)菌失活處理[5]。
1.4細(xì)胞培養(yǎng)和感染 人臍靜脈血內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)培養(yǎng)方法同前[10]。HUVECs在含10%熱失活FBS的Pigrow I 培養(yǎng)基、5% CO237 ℃孵箱中傳代。所有實(shí)驗(yàn)用HUVEC都是第5至第7代細(xì)胞。細(xì)胞維持用含3% FBS的Prigrow I 培養(yǎng)基。HUVEC長(zhǎng)匯合時(shí),收集并接種到24孔板培養(yǎng)。HUVEC再次長(zhǎng)匯合,添加Ang1(100 ng/mL)或/及OtK(MOI 10)。感染后24、48和72 h后,收集細(xì)胞,用于蛋白檢測(cè)或RT-PCR檢測(cè)。
1.5Western blot 將細(xì)胞或組織用含有蛋白抑制劑的裂解液裂解,電泳分離后將樣本轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,封閉后加兔抗鼠一抗:Ang2抗體(catalog #ab8452)或Tie2(ab137786)、p-Tie2(AF2720)、Akt(9272)、p-Akt(5012)、Foxo1(2880)、p-Foxo1(9461)、GATA2(ab109241)、VEGFR2(ab39256)、VE-Cadherin(ab33168)、HMGB1(ab227168)、β-actin(NB600-532)4°C過夜后,加熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG[Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP),#4050-O5]室溫作用1 h,再用ECL(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)顯色,ImageJ軟件定量并用β-actin的結(jié)果作歸一化處理。
1.6qRT-PCR 從肺臟組織和細(xì)胞樣本中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。對(duì)照為肺臟正常組織或僅加培養(yǎng)基的細(xì)胞。β-actin的引物為5′-CGAGGCCCAGAGCAAGAGAG-3′和 5′-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAG-3′,TNF-α為 5′-TGAGCACAGAAAGCATGATCC-3′和 5′-GCC-ATTTGGGAACTTCTCATC-3′,IFN-γ為 5′-AC-TGGCAAAAGGATGGTGAC-3′和 5′-TGAG-CTCATTGAATGCTTGG-3′,IL-6為 5′-GTTCTCTGGGAAATCGTGGA-3′和 5′-GAAATTGGGGT-AGGAAGGA-3′。
2.1OtK感染小鼠肺臟導(dǎo)致Tie2信號(hào)紊亂及炎癥因子表達(dá) 經(jīng)尾靜脈注射小鼠致死劑量細(xì)菌或PBS,在感染后第2、6、10 d 收集肺臟組織,Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),第6、10 d Tie2表達(dá)明顯下降;p-Tie2水平也呈相同趨勢(shì)(圖1A和圖1B)。Ang2表達(dá)升高,并于第2 d 達(dá)到峰值(圖1C)。炎癥因子HMGB1[11]隨著小鼠肺臟感染而表達(dá)增加(圖1D)。IFN-γ、TNF-α和IL-6的mRNA水平在第6、10 d 表達(dá)明顯增加(圖1E)。提示,OtK感染誘導(dǎo)小鼠肺臟Ang2產(chǎn)生并抑制Tie2信號(hào)激活,同時(shí)加重炎癥反應(yīng)。
Mice were infected with OtK or PBS(ctrl)for lung tissues collection at indicated days of infection(D2, D6, D10).(A)Lung tissue homogenates(20 μg/lane)were measured by Western blots for the levels of total Tie2 proteins,(B)phospho-Tie2(p-Tie2),(C)Ang2,(D)HMGB1, and compared with the β-actin controls.(E)TNF-α, IFN-γ and IL-6 mRNA levels in mouse lungs were measured via qRT-PCR; data are presented as relative mRNA values normalized to β-actin.Statistically significant values are referred to as *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001, respectively.(compared with lungs without infection).
2.2OtK感染內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致Tie2/Akt/Foxol信號(hào)紊亂 Otk感染 HUVEC 細(xì)胞后(圖2),Tie2表達(dá)增加,但p-Tie2水平持續(xù)降低。感染48 h,Tie2下游Akt表達(dá)升高,但p-Akt水平持續(xù)降低;感染48 h,F(xiàn)oxo1的磷酸化(p-Foxo1)水平?jīng)]有顯著變化,但Foxo1水平增加,提示Foxo1的去磷酸化增強(qiáng),細(xì)胞核內(nèi)積累增多,導(dǎo)致Foxo1靶基因的轉(zhuǎn)錄增加。Foxo1位于Akt下游,是一種轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控多種生理病理功能[12-13]。HMGB1是Foxo1的靶基因之一,其表達(dá)呈持續(xù)增加(圖2)。提示,OtK感染HUVEC細(xì)胞導(dǎo)致Tie2信號(hào)活性減弱和炎癥因子表達(dá)增強(qiáng),其結(jié)果支持小鼠肺臟感染結(jié)果。
(A)HUVEC were measured by Western blots for the levels of total Tie2 proteins, phospho-Tie2(p-Tie2), Akt, p-Akt, Foxo1, p-Foxo1 and HMGB1, and compared with the β-actin controls;(B)relative protein expression normalized to β-actin Statistically significant values are referred to as *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001, respectively.(compared with cells cultured just by medium at same culture time).(the arrow points the location of p-Foxo1).HUVEC were inoculated with MOI 10 OtK or PBS.
2.3Ang1可部分改善OtK感染內(nèi)皮細(xì)胞中Tie2信號(hào)的變化 Tie2的另一配體Ang1是由內(nèi)皮旁細(xì)胞表達(dá)而不在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá),因此在HUVEC培養(yǎng)過程加入重組人源Ang1或/并OtK,檢測(cè)此時(shí)Tie2信號(hào)變化。如圖3所示,感染48 h,Ang2表達(dá)明顯升高,Tie2和p-Tie2水平?jīng)]有顯著變化;感染72 h,Ang2表達(dá)進(jìn)一步增加,而Tie2和p-Tie2表達(dá)顯著降低。與不加Ang1的48 h 結(jié)果相比較(圖2),Ang1可部分改善或者推遲細(xì)菌對(duì)Tie2信號(hào)的抑制作用。
HUVECs were cultured to confluence, and then added Ang1(100 ng/ml)with or without Otk(MOI 10).Cells were collected at(A)48 and(B)72 hours and measured via Western blot.Shown are data from independent Experiment.Values for each protein were normalized to β-actin.n=3; *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001; ns, no significance(compared with Cells cultured just by medium).
2.4OtK感染內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)通透性蛋白的影響 培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞長(zhǎng)至匯合后,加入Ang1(100 ng/mL)或/并 OtK(MOI 10),48 h后收集細(xì)胞做WB檢測(cè)。結(jié)果如圖4所示,OtK感染顯著降低了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)、血管內(nèi)皮鈣粘蛋白(VE-Cad)和GATA結(jié)合蛋白2(GATA2)的表達(dá)。提示,OtK感染削弱內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定性。
(A)Cells were collected at 48 hours and measured via Western blot.Shown are data from independent Experiment.(B)Values for each protein were normalized to β-actin.n=3; *:P<0.05; **: P<0.01(compared with Cells cultured by Ang1 only).
盡管恙蟲病是一種重要的傳染性疾病,可能部分由于細(xì)菌培養(yǎng)、基因修飾或宿主-細(xì)菌間相互作用的可視化研究困難等因素,使其病理研究相對(duì)缺乏。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在嚴(yán)重恙蟲病東方體感染肺臟組織中,受體Tie2的轉(zhuǎn)錄和功能都顯著降低,提示Tie2/Ang媒介的內(nèi)皮細(xì)胞紊亂在嚴(yán)重恙蟲病中起重要作用[14],但其分子機(jī)制仍需深入研究。本文在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索了Orientiatsutsugamushi感染對(duì)Tie2信號(hào)及其下游通路的影響。
Tie2在血管重構(gòu)和上皮細(xì)胞穩(wěn)定方面起著至關(guān)重要的作用,導(dǎo)致胚胎致死性而無(wú)法得到Tie2敲除鼠。課題組對(duì)模型小鼠肺臟和內(nèi)皮細(xì)胞的Tie2信號(hào)活性進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)Tie2和功能性p-Tie2的水平隨著感染發(fā)展而持續(xù)降低;盡管不清楚是何種因子或網(wǎng)絡(luò)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞Tie2的活性,但可檢測(cè)激活內(nèi)皮細(xì)胞的促炎因子IFN-γ、TNF-α和IL-6表達(dá)顯著升高(圖1)。
Tie2及其下游Akt/Foxo1信號(hào)對(duì)血管成熟和穩(wěn)定非常關(guān)鍵,而蛋白磷酸化水平代表其活化程度。Orientiatsutsugamushi感染導(dǎo)致Tie2和Akt磷酸化程度降低,而Foxo1去磷酸化提高(圖2)。提示,Orientiatsutsugamushi對(duì)Tie2/Akt/Foxo1信號(hào)起抑制作用。
Ang2是Tie2的一個(gè)重要配體。Ang2既有組成型表達(dá),也有誘導(dǎo)型表達(dá),因?yàn)椴徽擉w內(nèi)體外實(shí)驗(yàn),感染或未感染樣本,Ang2都有表達(dá)。隨著感染進(jìn)程的發(fā)展,Ang2表達(dá)增加,而Tie2和p-Tie2卻不斷降低,提示Orientiatsutsugamushi感染使Ang2對(duì)Tie2有抑制作用,而在未感染時(shí)Ang2可能有保持Tie2信號(hào)活性的作用(圖1和圖3)。Tie2的另一個(gè)配體Ang1,可部分恢復(fù)或者推遲感染對(duì)Tie2信號(hào)的抑制。
除Tie2信號(hào)外,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR2),血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素(VE-Cad)和GATA結(jié)合蛋白2(GATA2)在血管維持與更新中均起重要作用,影響細(xì)胞通透性。而Orientiatsutsugamushi的感染導(dǎo)致這幾種蛋白表達(dá)降低(圖4),提示感染可抑制多種內(nèi)皮細(xì)胞間穩(wěn)定關(guān)系,從而增加其通透性。
本研究從一種新視角探索嚴(yán)重恙蟲病的致病機(jī)制,通過分析Orientiatsutsugamushi對(duì)小鼠肺臟及內(nèi)皮細(xì)胞的影響,發(fā)現(xiàn)Tie2/Akt/Foxo1信號(hào)的失活可能是內(nèi)皮細(xì)胞失穩(wěn)的重要因素,提示Tie2信號(hào)可能是保護(hù)嚴(yán)重恙蟲病患者血管免受損傷的潛在治療靶點(diǎn)之一。
利益沖突:無(wú)