王 蔚 鐘 霞 杜 淵 王洪連 譚睿陟 沈宏萍 王 麗 楊思進（西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000）

腦出血是威脅人類健康的嚴重疾病之一［1］，腦水腫是腦出血后重要的繼發(fā)性病變，同時也影響著該病的發(fā)展和預(yù)后，成為急性期臨床治療的關(guān)鍵，如果能在腦水腫形成的初期有效控制水腫的發(fā)生，將有助于腦出血神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的恢復(fù)，提高患者生活質(zhì)量［2］。通過前期的臨床研究，我們發(fā)現(xiàn)，具有活血化瘀通絡(luò)的蛭龍活血通瘀膠囊能有效治療腦出血，改善患者的神經(jīng)功能［3］。本實驗通過觀察蛭龍活血通瘀膠囊對大鼠腦出血后腦含水量、腦系數(shù)以及血腦屏障緊密連接蛋白ZO-1、Occludin mRNA的表達，探尋該藥防治腦出血的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性健康的SPF級SD大鼠，共96只，體質(zhì)量（280±20）g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，許可證號為SYXK（川）2018-065。飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學實驗動物研究中心，環(huán)境溫度（22±2）℃，濕度30%～40%，普通飼料喂養(yǎng)，自由攝食及飲水。

1.2 藥物及儀器 蛭龍活血通瘀膠囊（主要成分：黃芪、水蛭、地龍、大血藤、桂枝等），規(guī)格0.4 g/粒，由西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，批號為20180216；鹽酸法舒地爾注射液，規(guī)格2 mL∶30 mg/支，成都菀東藥業(yè)有限公司，批號180101；兔抗鼠ZO-1多克隆抗體：Thermo Fisher；兔抗鼠Occludin多克隆抗體：Gene Tex；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：Thermo scientific；大鼠腦立體定位儀：北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司；ATPB457A小動物電子秤：深圳安普特電子科技有限公司；BSA224S精密電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；TH-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱：南京同皓干燥設(shè)備有限公司；Centrifuge 5424 R臺式高速冷凍離心機，DYY-10C電泳儀：北京六一儀器廠；德國Eppenderf；NanoDrop 2000超微量分光光度計：Thermo scientific；LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀：瑞士Roche。

1.3 模型制備 大鼠稱體質(zhì)量后以400 mg/kg腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，距尾尖0.5 cm處剪斷鼠尾，取血50 μL備用。用腦立體定位儀以大鼠俯臥位固定鼠頭，常規(guī)備皮及消毒后，沿頭皮正中縱向切開約10 mm，用30%雙氧水腐蝕骨膜使前囟及冠狀縫充分暴露，調(diào)節(jié)定位儀X、Y軸坐標以定位尾殼核區(qū)域，使針尖垂直于矢狀縫右側(cè)3.0 mm，前囟前0.2 mm處，用三棱針在針尖下鉆開顱骨，以顱骨外板為零點調(diào)節(jié)定位儀Z軸，進針深度為6.0 mm，以5 μL/min勻速將血緩慢注入，留針約15 min后緩慢退針，用骨蠟將鉆孔封閉，術(shù)后頭皮并常規(guī)縫合消毒［4-5］。假手術(shù)組大鼠只進針不注血。術(shù)后按照“5分制法”對大鼠進行神經(jīng)功能評分［6］，評分為1～3分則認為造模成功，可納入實驗。

1.4 分組及給藥 實驗大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、蛭龍活血通瘀組（中藥組）、鹽酸法舒地爾組（西藥組），各24只，各組又分為12 h、48 h、3 d、7 d 4個亞組，每個亞組6只。中藥組給予蛭龍活血通瘀膠囊灌胃，每日1.2 g/kg，灌胃體積為3 mL［7］；西藥組給予鹽酸法舒地爾注射液腹腔注射，每日12 mg/kg［8］；假手術(shù)組和模型組每日均給予同中藥組等體積的生理鹽水灌胃。

1.5 標本采集與檢測 1）腦含水量、腦系數(shù)。大鼠在實驗規(guī)定的時點稱重麻醉，快速斷頭取腦，去除軟腦膜及表面血液，切取雙側(cè)大腦半球組織置于電子天平稱重后，切取右側(cè)大腦組織稱出血側(cè)腦濕重，再將其以110℃24 h烘干至恒重，稱出血側(cè)腦組織干重。腦組織含水量及腦系數(shù)計算公式為：腦組織含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%；腦系數(shù)（%）=全腦質(zhì)量/體質(zhì)量×100%［9］。2）腦組織 ZO-1、Occludin mRNA。大鼠在實驗規(guī)定的時點深度麻醉后，快速取出腦組織，去除軟腦膜及表面血液，切取出血側(cè)大腦半球血腫周圍腦組織，置于試管中，立即保存至-80℃冰箱。用Trizol法提取總RNA，根據(jù)ZO-1、Occludin的cDNA序列，由上海生物工程有限公司合成引物。ZO-1：上游5'-CGCAGCCAGTTCAAACAAAGTTCC-3'；下游 5'-GCAACATCAGCAATCGGTCCAAAG-3'。Occludin：上游 5'-CAACGGCAAAGTGAATGGCAAGAG-3'；下 游 5'-TCATCCACGGACAAGGTCAGAGG-3'。逆轉(zhuǎn)錄后按95℃ 10 min預(yù)變性，40個循環(huán)（變性95℃ 15 s，55℃15 s，72℃ 30 s）進行Real-time PCR擴增，用熒光定量PCR儀進行常規(guī)溶解曲線分析測定Ct值，以2-ΔΔCT的計算值作為相對表達水平［10］。

1.6 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。采用單因素方差分析、LSD及Dunnett法進行多重比較。定量資料以（）表示。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦含水量比較 見表1。假手術(shù)組腦含水量在各時點均無明顯改變（P＞0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組、中藥組、西藥組各時點腦含水量均有不同程度升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；模型組術(shù)后腦含水量3 d時升高最為明顯，7 d時有所下降；與模型組比較，中藥組、西藥組各時點腦含水量均有不同程度降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表1 各組大鼠腦含水量比較（%，±s）

表1 各組大鼠腦含水量比較（%，±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組中藥組西藥組n 3 3 3 3術(shù)后12 h 76.593±0.185 80.409±0.484*79.144±0.158*△79.281±0.243*△術(shù)后48 h 76.538±0.224 81.130±0.116*79.330±0.103*△79.413±0.191*△術(shù)后3 d 76.583±0.083 82.242±0.118*79.583±0.320*△79.628±0.060*△術(shù)后7 d 76.540±0.163 79.743±0.548*78.325±0.778*△78.491±0.631*△

2.2 各組大鼠腦系數(shù)比較 見表2。假手術(shù)組大鼠腦系數(shù)在各時點均無明顯改變（P＞0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組、中藥組、西藥組各時點腦系數(shù)均有不同程度升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；模型組術(shù)后腦系數(shù)3 d時升高最為明顯，7 d時有所下降；與模型組比較，中藥組、西藥組各時點腦系數(shù)均有不同程度降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表2 各組大鼠腦系數(shù)比較（%，±s）

表2 各組大鼠腦系數(shù)比較（%，±s）

組別假手術(shù)組模型組中藥組西藥組n 3 3 3 3術(shù)后12 h 0.520±0.010 0.644±0.014*0.601±0.003*△0.603±0.002*△術(shù)后48 h 0.519±0.010 0.653±0.007*0.605±0.004*△0.607±0.004*△術(shù)后3 d 0.522±0.005 0.685±0.005*0.612±0.006*△0.613±0.010*△術(shù)后7 d 0.521±0.005 0.638±0.011*0.582±0.008*△0.594±0.011*△

2.3 各組大鼠腦組織ZO-1 mRNA水平比較 見表3。假手術(shù)組大鼠腦組織ZO-1 mRNA水平在各時點均無明顯改變（P＞0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組、中藥組、西藥組各時點腦組織ZO-1 mRNA水平均有不同程度降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組術(shù)后ZO-1 mRNA水平于3 d時降低最為明顯，7 d時有所回升；與模型組比較，中藥組、西藥組各時點腦組織ZO-1 mRNA水平均有不同程度升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腦組織ZO-1 mRNA水平比較（±s）

表3 各組大鼠腦組織ZO-1 mRNA水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組中藥組西藥組n 3 3 3 3術(shù)后12 h 1.168±0.031 0.402±0.084*0.586±0.078*△0.607±0.066*△術(shù)后48 h 1.178±0.077 0.201±0.067*0.428±0.045*△0.398±0.013*△術(shù)后3 d 1.152±0.048 0.177±0.031*0.350±0.059*△0.324±0.051*△術(shù)后7 d 1.176±0.007 0.430±0.079*0.845±0.108*△0.851±0.100*△

2.4 各組大鼠腦組織Occludin mRNA水平比較 見表4。假手術(shù)組大鼠腦組織Occludin mRNA水平在各時點均無明顯改變（P＞0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組、中藥組、西藥組各時點腦組織Occludin mRNA水平均有不同程度降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組術(shù)后Occludin mRNA水平3 d時降低最為明顯，7 d時有所回升；與模型組比較，中藥組、西藥組各時點腦組織Occludin mRNA水平均有不同程度升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表4 各組大鼠腦組織OccludinmRNA水平比較（±s）

表4 各組大鼠腦組織OccludinmRNA水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組中藥組西藥組n 3 3 3 3術(shù)后12 h 12.597±0.416 3.608±0.394*5.727±0.206*△5.927±0.816*△術(shù)后48 h 12.587±0.185 2.479±0.331*4.587±1.161*△4.860±0.753*△術(shù)后3 d 12.486±0.092 1.419±0.269*2.751±0.282*△2.930±0.710*△術(shù)后7 d 12.505±0.320 4.786±1.401*6.775±0.377*△7.081±0.466*△

3 討 論

腦出血即出血性卒中，在中醫(yī)學中屬于廣義的中風病范疇，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中便有對該病病名、病因病機及疾病分類等的描述。歷代醫(yī)家對本病病機的認識包括外風致病、內(nèi)風致?。ǜ物L），另與痰濁、瘀血、氣郁、氣虛、毒損腦絡(luò)等息息相關(guān)［11］。課題組結(jié)合前人理論基礎(chǔ)，認為本病的病因主要責之于外風直中或肝風內(nèi)動，痰濕與瘀血互結(jié)，終至血溢脈外，為本虛標實之證。其本虛以氣虛為要，其標為風、痰和瘀?；颊甙l(fā)病多為在素體氣損不足的基礎(chǔ)上，復(fù)受風邪外侵，引動體內(nèi)肝風，氣機失調(diào)，風陽上擾清竅，另由內(nèi)停之痰濁、瘀血，致使氣機阻滯，脈絡(luò)瘀阻，腦絡(luò)不通，日久脈沖血溢而致神機失用，故而為病。因此，本病的治療需緊扣其基本證候要素氣虛風痰瘀阻。治療方面兼顧益氣、活血、逐瘀、通絡(luò)、祛風、平肝、化痰、開竅為法。中醫(yī)學認為“離經(jīng)之血便是瘀”“瘀血不去則新血不生”“治風先治血，血行風自滅”，根據(jù)此中醫(yī)基礎(chǔ)理論及病因病機認識，課題組將具有益氣祛風、活血化瘀通絡(luò)等功效的專科院內(nèi)制劑蛭龍活血通瘀膠囊用于出血性中風病的治療。蛭龍活血通瘀膠囊組方中君藥黃芪用量大，意在補氣，以達生血攝血、行氣導(dǎo)滯，所謂“氣行則血行”“氣行則痰除”。佐以桂枝少量入方，體現(xiàn)“病痰飲者，當以溫藥和之”，并能溫通經(jīng)脈、祛風解肌，如《名醫(yī)別錄》言“宣導(dǎo)百藥”，起“引經(jīng)藥”的作用。此外方中臣以有活血化瘀功效的藥物包括水蛭、大血藤。水蛭善于通經(jīng)脈逐瘀血，另有利尿通淋、息風止痙之效；大血藤既活血通絡(luò)，又養(yǎng)血祛風，清熱解毒；地龍清熱平肝，息風止痙，利尿通絡(luò)。全方共奏益氣活血、化瘀通絡(luò)、平肝息風之效。

咬合蛋白Occludin和閉鎖小帶蛋白ZO-1是血腦屏障緊密連接的主要成分，對維持血腦屏障結(jié)構(gòu)的完整性具有重要作用，與血腦屏障的通透性及腦水腫形成密切相關(guān)［12-14］。動物實驗證明［15-16］，正常SD大鼠腦組織中Occludin的表達呈現(xiàn)強陽性，而腦出血大鼠腦組織內(nèi)Occludin的表達明顯降低，在出血6 h時即開始下降，至腦出血后24、72 h時，Occludin持續(xù)在較低水平，定量RT-PCR結(jié)果亦顯示在腦出血后，血腫周圍腦組織的Occludin mRNA水平明顯降低，并在72 h內(nèi)均維持在較低的水平。研究報道顯示［17］，黃芪對血腦屏障超微結(jié)構(gòu)損壞具有改善作用，用藥后因疾病導(dǎo)致的緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達減少情況有所改善，能夠減輕腦組織出血轉(zhuǎn)化的發(fā)生。經(jīng)本實驗研究證實，與模型組比較，蛭龍活血通瘀膠囊能明顯降低腦出血大鼠腦含水量、腦系數(shù)，并上調(diào)腦組織Occludin mRNA及ZO-1 mRNA的表達。由此我們認為，蛭龍活血通瘀膠囊能明顯改善腦出血后腦組織水腫，其作用機制可能與上調(diào)血腫周圍組織ZO-1及Occludin mRNA的表達有關(guān)。