李文韜，王金武

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院骨科，上海200011

自1986年3D打印技術問世后，其應用范圍迅速擴展至包括生物醫(yī)療在內的各個領域，極大促進了相關領域的技術進步與行業(yè)發(fā)展［1］。在再生醫(yī)學領域，利用3D 打印技術可以快速制造具有可控孔隙率和內部結構的組織支架，并可以通過加載藥物或生長因子調節(jié)細胞所處微環(huán)境，促進組織再生。近年來，隨著細胞生物學、材料科學的發(fā)展及3D 打印技術的進步，生物打印發(fā)展迅猛，受到科研人員及大眾越來越多的關注，被視作推動組織工程向功能性組織發(fā)展，最終緩解移植器官短缺問題的希望［2］。

生物打印是一種通過計算機輔助，同時將生物材料、活細胞及其他生物活性物質層層打印，堆疊形成用于再生醫(yī)學、疾病模型、藥物篩選或其他生物學研究的生物工程結構的技術［3］。目前，生物打印在打印如皮膚、軟骨等不需要血管化的薄層組織上已取得部分成功，能夠在實驗室環(huán)境下穩(wěn)定構建這類組織［1-2］。然而，對于打印大塊組織的血管化問題目前還存在困難，原位生物打印可以作為一個解決方案。原位生物打印可以通過將植入物與自體組織整合，借助體內自然驅動的血管化過程，募集內源性內皮細胞，實現植入物的血管化，形成新的功能化組織器官。

原位生物打印的概念最早由Campbell 等［4］提出，旨在利用噴墨打印技術直接在生物體內進行生物打印，促進組織修復和再生。然而，由于目前技術不成熟且許多外科醫(yī)師也缺乏相關技能，這項技術尚不能真正應用于臨床。目前，對于原位生物打印的研究逐漸深入，并在皮膚、骨、軟骨的修復上展現了巨大的潛力［5］。本文對目前原位打印的技術、優(yōu)勢、目前發(fā)展情況以及未來的發(fā)展方向進行綜述。

1 概述

1.1 一般方法

原位生物打印是一種直接將生物墨水打印至生物體內缺損部位，以創(chuàng)建或修復活組織或器官的技術，其打印位置位于生物體內［5-7］。一般先通過CT、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）或光學掃描等技術掃描缺損部位的幾何形狀，然后通過計算機輔助規(guī)劃打印路徑，最后按照預定方案選擇合適的生物打印方法將生物墨水打印到體內合適的位置。

1.2 打印技術

目前的生物打印方式可分為三大類，即基于液滴的生物打印（droplet-based bioprinting， DBB）［8］、基于擠壓的生物打?。╡xtrusion-based bioprinting， EBB）［9］和基于激光的生物打?。╨aser-based bioprinting，LBB）［10］。

DBB 打印機通過將生物墨水噴灑到沉積表面來構建3D 活體結構［8］。這項技術較為成熟，有大量的商業(yè)平臺可以使用，且可以實現多種生物墨水亞微米級別的高分辨率打印。此外，DBB 打印機可以將液滴噴射到打印位置，實現非接觸打印，減少打印頭對正常組織及打印結構的影響。然而，由于其打印過程中需要打印頭進行較大范圍的移動來控制生物墨水沉積的位置，使得這項技術僅適用于表面組織的打印修復，無法實現如關節(jié)軟骨等深層組織的微創(chuàng)化修復，限制了其在原位生物打印中的應用。

LBB 打印機利用激光將生物材料固化成精細結構［10］。細胞的激光直寫是一種廣泛使用的生物印刷方法，它利用激光脈沖選擇性地將細胞從供體容器轉移到沉積位置上構建3D 活體結構。這種打印技術可以實現微米級別的高精度打印，但是由于細胞暴露于激光下，可能降低細胞的存活率。此外，激光源尺寸較大，難以進入體內，需要通過類似內窺鏡等設備的光纖結構將激光傳導至打印位置。這使得打印機結構更加復雜，對打印設備的穩(wěn)定性及精準度會產生一定影響。

EBB 是將生物墨水從噴嘴中擠出形成特定3D 生物結構的打印方法［9］，目前有大量生物打印機基于這一技術制造。這一技術較為成熟，且與關節(jié)鏡、腹腔鏡等現有手術設備兼容，與前述2種技術相比，應用于體內原位生物打印難度更低；但是，這一技術應用于原位生物打印在某些方面還需要改進，如提高打印精度、將打印設備小型化等。

1.3 控制系統(tǒng)

1.3.1 機械臂控制系統(tǒng) 機械臂作為控制系統(tǒng)，一般需通過計算機輔助設計或計算機輔助制造確定打印的結構，并對打印路徑進行規(guī)劃；然后，根據預先的設定控制機械臂以控制生物墨水中各組分的空間位置，構建預先設定的結構。該過程也應在外科醫(yī)師的控制下（如使用達芬奇手術系統(tǒng)）執(zhí)行，方便根據實際情況調整打印方案。該系統(tǒng)的臨床適用性已通過動物實驗進行了部分驗證［11-16］。但由于技術所限難以微創(chuàng)化，目前的試驗局限于皮膚、顱骨缺損等相對表淺位置的打印。在未來，可以通過對機械臂結構的改良將設備小型化，實現深層組織的打印。

1.3.2 手持式設備 手持式生物打印設備是一種帶有生物打印單元的便攜式設備，典型的手持設備包含手柄、1 個或多個墨盒、噴嘴、電動或氣動擠出系統(tǒng)等部分［17］。與機械臂控制的設備相比，手持生物打印設備具有許多優(yōu)點，如手持式設備更加便攜，對使用環(huán)境的要求更低，更適合于創(chuàng)傷的治療，且技術難度與成本大幅降低。然而，由于使用手持式設備很難打印復雜的結構，該設備只適用于簡單結構的打印，如用于皮膚創(chuàng)傷的修復。機械臂控制系統(tǒng)則可以幫助打印復雜的組織結構，并且，可以根據需要應用不同類型的細胞及生物材料獲得更精細的組織結構，這是手持式設備難以實現的。

這2種方法并沒有絕對的優(yōu)劣之分，控制系統(tǒng)的選擇取決于所打印的組織或器官的解剖位置和復雜性，而2種方法的結合可以用來打印復雜的組織結構并保持手術靈活性。

1.4 原位打印的優(yōu)勢

傳統(tǒng)的生物打印方法所得到的組織很難完全匹配缺損的形狀。首先，在進行影像學掃描時可能有較大的誤差；此外，從打印形成組織到植入一般需要較長的時間，在這期間缺損形狀也會發(fā)生變化，而且在植入時可能需要先進行清創(chuàng)。此外，體外生物打印的組織在植入體內的過程中容易發(fā)生破損，無法完全匹配設計的形狀，甚至破壞重要結構，影響組織修復效果。原位生物打印技術則可以完全匹配缺損的形狀進行修復，且不會在植入過程中損傷植入物，保證了組織修復效果［6］。

傳統(tǒng)的生物打印需要將打印的組織置于體外生物反應器中培養(yǎng)，生物反應器必須盡可能模擬體內環(huán)境。根據目前的研究很難徹底明確細胞在體內所處的微環(huán)境，更無法完全模擬體內環(huán)境［18］。采用原位生物打印的方法可直接將生物體當作生物反應器誘導組織分化成熟，并且，可以避免體外長期培養(yǎng)中可能出現的污染，相比體外誘導更加簡單高效。此外，采用原位生物打印技術進行組織修復不需要體外培養(yǎng)植入物的過程，需要的準備時間更短，治療的時效性更好。

原位生物打印也可以實現微創(chuàng)化，可以通過小切口完成組織器官的打印，甚至可以在體內打印電極等植入式醫(yī)療器械。同時，通過原位生物打印技術進行一期手術修復，不需要先取種子細胞在體外構建組織后再行第二次手術植入人工組織，可以減少治療過程中的創(chuàng)傷。

2 原位生物打印的應用領域

2.1 皮膚

在醫(yī)療實踐中，由于創(chuàng)傷、燒傷以及各種慢性傷口（如糖尿病、壓瘡等）所造成的皮膚損傷較常見。傳統(tǒng)方法如自體皮膚移植，皮膚來源受限，準備時間長，因此治療及時性差，3D 生物打印可以較好地解決這一問題。皮膚作為人體最大和最表淺的器官，是最適合進行原位生物打印治療的器官。目前，已有許多針對皮膚缺損的原位生物打印研究［14，19-20］，并在動物實驗中取得了一定進展。

2010 年Binder 等［20］使用噴墨3D 皮膚打印機將人角質形成細胞和成纖維細胞直接打印到小鼠皮膚缺損處，觀察到缺損處皮膚完全形成，證明了原位生物打印用于小鼠皮膚缺損修復的可行性。在另一項研究中，Sofokleous 等［21］設計了一種手持式電流體噴射槍，可以產生顆粒和纖維形式的聚合物，能夠更好地模擬細胞外基質，促進皮膚的再生。

Albanna等［14］開發(fā)了一種移動式皮膚生物打印系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過將自體真皮成纖維細胞和表皮角質形成細胞連同纖維蛋白原-膠原水凝膠直接打印到豬皮膚缺損模型中來修復缺損；與其他治療方法（包括同種異體細胞打印、基質凝膠打?。┖臀刺幚斫M相比，自體細胞打印處理的傷口愈合速度更快且愈合效果更好。

2.2 軟骨

骨關節(jié)炎是最常見的退行性關節(jié)疾病，會導致關節(jié)軟骨的炎癥和損傷?，F有的軟骨缺損治療方法包括自體軟骨細胞植入、清理術、骨膜移植等；然而，這些方法的臨床研究結果未能顯示出可靠療效［22］，而原位生物打印對于軟骨的修復可能會取得更好的效果［17，23-25］。

O'Connell 等［17］于2016 年發(fā)明了一種手持氣動式生物打印筆用于軟骨缺損的修復，基于其特殊的噴嘴設計，可以用不同生物材料打印出同軸的殼/核結構；在這種結構中細胞位于內部的核中，在利用紫外光固化材料的過程中外部的殼可以減少紫外光對內部細胞的影響；體外研究表明，人脂肪干細胞在打印1周后的水凝膠中仍具有很高的活性。隨后，該課題組［24］利用該裝置進行了綿羊動物實驗，結果表明，體內生物打印組相比體外生物打印構建植入物和微骨折組有更好的宏觀和微觀特征。

2.3 骨

骨缺損可由創(chuàng)傷、感染、腫瘤手術以及各種先天性疾病等多種原因造成。傳統(tǒng)的治療方法是使用植入物，如自體骨或骨水泥等生物材料填補缺失的部分，提供機械強度和結構支撐；但這種方法不能提供永久性的治療，在修復后可能需要再次翻修［26］。原位生物打印則具有使缺損部位骨組織再生的潛力［11-12，15，27］，可提供終身解決方案。

2010 年Cohen 等［12］使用基于機器人的擠壓式生物打印系統(tǒng)將藻酸鹽水凝膠打印到離體牛股骨骨軟骨缺損上。2017 年Li 等［28］通過高分辨率3D 掃描獲得了骨骼缺損區(qū)域的精確范圍，然后，利用原位打印技術使用藻酸鹽-聚乙二醇水凝膠進行離體缺損修復。雖然這些研究僅在離體骨上進行了試驗，且所用材料在臨床應用中具有一定局限性，但研究證明了原位打印系統(tǒng)也可以實現高精度打印。

Keriquel 等［11］通過將納米羥基磷灰石激光原位打印以微創(chuàng)方式修復了小鼠顱骨缺損。其后，Keriquel 等［13］又利用類似方法將間充質干細胞、納米羥基磷灰石和Ⅰ型膠原作為生物墨水修復小鼠顱骨缺損；結果顯示，該方法能夠有效修復顱骨缺損，且激光對于小鼠腦組織并未造成傷害。這證明了激光輔助生物打印也可以作為原位生物打印的一種手段。

2.4 植入式醫(yī)療器械

植入式醫(yī)療器械，如神經電刺激器、心臟起搏器、藥物檢測系統(tǒng)等植入式設備對疾病的治療和管理起到重要作用；但這類設備植入大多需要手術操作，流程復雜、創(chuàng)傷較大，不可避免地給患者帶來生理上的痛苦和心理上的負擔。因此，迫切需要尋找一種新的植入方法，簡單、安全地完成醫(yī)療器械植入。

Jin 等［29］以植入式電極為突破點，提出了一種利用原位打印技術在體內直接構建植入式醫(yī)療器械的方法。研究者們將生物相容性的封裝材料及液態(tài)金屬依次注射于體內并固化形成特定結構，實現了電極的微創(chuàng)化植入，未來還可能打印植入更復雜的結構；他們還進行了初步動物實驗，利用此方法在小鼠體內植入電極，成功記錄到小鼠心電圖，并通過該電極對小鼠施加電刺激觀察到相應心電圖變化。Sun 等［30］將液態(tài)金屬電極加入電化學治療腫瘤的方案中，將液態(tài)金屬注射到腫瘤組織內，結合傳統(tǒng)鉑電極施加電刺激，在動物實驗中證實了該方案的優(yōu)勢。

3 挑戰(zhàn)與展望

3.1 生物墨水

除了滿足足夠的機械強度、可降解性、細胞活性等要求外，用于原位生物打印的墨水還應具有可快速固化及不需要紫外光或化學固化劑等優(yōu)點。雖然O'Connell等［17］在打印過程中使用了紫外光固化，但這種固化方式可能對周圍正常組織產生不利影響，在臨床中應盡量避免使用。Li 等［31］報道了一種新型的多肽-DNA 水凝膠，通過交替印刷多肽-DNA 墨水與DNA 交聯(lián)劑可以實現快速固化，并且不需要化學交聯(lián)和光固化過程，避免了對周圍正常組織的影響。

此外，由于當前生物打印技術的限制，打印結構難以完全模擬生物體原有結構，而且打印出的結構無法隨組織再生的過程發(fā)生相應變化以進一步促進組織再生。各種刺激響應生物墨水為解決這些問題提供了方向，這類墨水不僅可以在打印后實現精細結構的自組裝，還可以通過磁場、組織微環(huán)境的變化使打印結構出現相應改變或釋放適當的因子，更好地促進組織再生［32-34］。

3.2 打印系統(tǒng)

如果原位打印設備最終能夠應用于手術室，那么外科醫(yī)師將成為其主要用戶，而讓外科醫(yī)師精通生物打印技術并能夠穩(wěn)定高質量地打印組織是很困難的。因此，可在原位生物打印系統(tǒng)中整合先進的外科技術，如機器人輔助系統(tǒng)，盡可能減少打印過程中需要人為設定的參數，最大程度保證打印過程的自動化，利于設備推廣應用［6］。這就需要開發(fā)配套人工智能軟件，自動規(guī)劃打印路徑，設定打印參數，而操作者只需監(jiān)控整個打印過程并對打印過程進行簡單調整。

在設備設計的過程中，另一個需要考慮的重要因素是小型化。在這方面手持式設備具有天然的優(yōu)勢，醫(yī)護人員可以隨身攜帶并用于急性創(chuàng)傷的救治。但是，手持式設備只能進行一些簡單的打印，要想真正實現復雜器官打印還需要機器人的參與。在機器人設計的過程中也應考慮到在打印過程中所造成的創(chuàng)傷，可以采用類似達芬奇手術系統(tǒng)的結構，通過小切口完成打?。?5］。此外，缺損和打印基底的不規(guī)則要求控制系統(tǒng)具有更大的運動范圍和自由度，以提高打印靈活性，使用多軸機械臂作為控制系統(tǒng)進行打印可以更好地應對復雜結構，更好地實現微創(chuàng)化。美國Advanced Solutions 公司開發(fā)的BioAssemblyBot 打印機［35］就是一款基于6 軸機械臂的生物打印機，可以更好地實現對復雜結構的打印，更加適合原位生物打印。

3.3 掃描系統(tǒng)

對于體外生物打印來說，由于在打印前無法直視缺損位置，往往需要采用CT 或MRI 等影像學方法確定缺損形狀，建立模型。而由于原位打印過程通常可以做到直視缺損部位，完全可以通過高精度3D 掃描儀對缺損部位進行掃描，其精度可以遠遠超過傳統(tǒng)影像學手段。如在Li 等［28］的研究中就采用了手持式3D 掃描儀用于創(chuàng)建立體光刻（stereo lithography，STL）文件。對于表淺位置的3D 掃描技術是成熟的，但對于一些深部組織需要通過關節(jié)鏡、腹腔鏡等進行掃描建模，這方面的技術還需要進一步研究。

3.4 反饋系統(tǒng)

在體內進行生物打印時很可能會受到呼吸、抽搐等的影響，這很大程度上限制了原位生物打印的應用范圍。要想克服這個問題就需要在原位打印設備中集成一套可靠的反饋系統(tǒng)，根據打印位置的移動變化對打印方案自動進行合理的調整。Zhu 等［36］的一項研究有希望克服這一問題，他們開發(fā)了一種基于擠壓的自適應打印技術，集成了閉環(huán)反饋和基于計算機視覺的控制系統(tǒng)，以實時校正動態(tài)打印表面造成的打印錯誤。視覺跟蹤系統(tǒng)包括固定在3D 打印機末端的2 個機器視覺攝像頭，能夠對打印表面進行精確定位。將幾何信息與目標表面任意運動的實時估計相結合，作為運動控制器的輸入信息進行自適應3D打印。

3.5 血管化組織大塊缺損的修復

雖然在體內進行生物打印可以將機體作為生物反應器，利用組織微環(huán)境促進打印組織的血管化，但這需要一個較長的過程，在血管化之前需要保證打印組織的多孔結構，以促進養(yǎng)分在打印組織內的運輸及廢物的排除，直至新生血管的生成［3］。另一個主要問題是生長因子難以滲透到打印組織的中央，而這些生長因子是誘導干細胞分化所必需的，這一困難可以通過基因療法來克服。例如，可以將帶有特定基因的腺病毒作為基質進行打印，形成基因活化基質（gene activated matrix，GAM），利用GAM 可促進打印組織中的細胞表達相關生長因子，形成利于細胞定向分化的微環(huán)境［37］。

4 結語

總之，原位生物打印目前還只是一個概念性的想法，要想真正走向臨床，在生物墨水、打印精度、設備的微型化、機械臂的自由度以及整個系統(tǒng)軟件的自動化程度等方面都需要取得重大突破，這一過程可能會耗費數十年的時間。但是，不可否認原位生物打印所具有的諸多優(yōu)勢可能會使得其成為生物打印的一個重要發(fā)展方向。