趙彬，李凱，薛旭紅，趙勝

(1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，山西 太原 030001)

脊柱側(cè)凸是指脊柱椎體向側(cè)方移位并伴有椎體旋轉(zhuǎn)的三維結(jié)構(gòu)性畸形。國際脊柱側(cè)凸研究協(xié)會定義脊柱側(cè)凸為測量全脊柱正側(cè)位X線片Cobb角>10°[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球青少年脊柱側(cè)凸的發(fā)病率為1%～3%[2]。該疾病的發(fā)生可涉及多種因素，相關(guān)的病因?qū)W機(jī)制及遺傳背景尚未明確。為研究該疾病的具體發(fā)病機(jī)制而進(jìn)行人類隨機(jī)對照試驗(yàn)不符合相關(guān)的醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求[3]，動物模型便成為了研究其病因?qū)W及遺傳學(xué)的重要工具，合適的脊柱側(cè)凸動物模型對研究人員及臨床醫(yī)生深入研究該疾病的病因及病理方面有重大意義。

迄今為止，已通過各種誘導(dǎo)方式成功構(gòu)建了雞、兔子、青蛙、豬、山羊、綿羊及靈長類動物的脊柱側(cè)凸模型[4]。但相關(guān)研究表明：鼠類作為經(jīng)典的脊椎類哺乳動物與人類的基因組高度相似[5]；人類已經(jīng)可以成功改變小鼠基因組類型，構(gòu)建各種基因修飾、敲除模型；兩足大鼠和小鼠在不同的模型中脊柱側(cè)凸發(fā)生率明顯高于其他動物[6]；鼠類脊柱側(cè)凸模型可以較好的反映出與疾病相關(guān)的病理過程[1-6]。此外，由于鼠類操作簡單、成本較低、繁殖周期快等特性可以在短期內(nèi)產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)樣本[7]，目前已成為研究脊柱側(cè)凸相關(guān)問題的有力工具。本文將分別對先天性脊柱側(cè)凸(congenital scoliosis，CS)和特發(fā)性脊柱側(cè)凸(idiopathic scoliosis，IS)近年來常用的鼠類動物模型作一綜述。

1 先天性脊柱側(cè)凸(congenital scoliosis，CS)

CS是指母體妊娠期4～6周內(nèi)，由于脊柱先天性發(fā)育異常引起椎體畸形或分割失敗而導(dǎo)致脊柱矢狀位排列紊亂[8]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，新生嬰兒CS的發(fā)病率為0.5%～1.0%[9]。目前較常用的鼠類CS動物模型有以下兩種。

1.1 妊娠期雌鼠暴露于一氧化碳(CO)環(huán)境中構(gòu)建CS模型 相關(guān)研究已證實(shí)：CO環(huán)境因素對孕婦、胎兒、新生嬰兒有一定的生物學(xué)致畸作用[10]，CO在機(jī)體內(nèi)與氧競爭血紅蛋白結(jié)合位點(diǎn)，干擾組織氧合作用。母體在懷孕期間暴露于CO環(huán)境中，CO可通過胎盤作用于胎兒組織從而導(dǎo)致胎兒椎體發(fā)生異常。Loder等[11]選用DBA-1J系雌性小鼠，將懷孕的雌鼠暴露于200、400、600ppmCO環(huán)境中，新生幼鼠行脊柱X線檢查觀察先天性脊柱畸形，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明在600ppmCO環(huán)境中脊柱畸形發(fā)生率為77%。并在雌鼠妊娠21天周期內(nèi)的不同時期分組暴露于600ppmCO環(huán)境中7h，結(jié)果雌鼠妊娠期內(nèi)易受CO環(huán)境影響的時期為第9.5天。Farley等[12]在Loder等的研究基礎(chǔ)上，追蹤C(jī)O環(huán)境下產(chǎn)生的先天性脊柱畸形幼鼠脊柱側(cè)凸的發(fā)展；選用DBA-1J系雌鼠在妊娠期第9.5天持續(xù)暴露于600ppmCO環(huán)境下，幼鼠出生后第42、54、61天對其進(jìn)行影像學(xué)檢查以及病理切片觀察組織學(xué)形態(tài)，發(fā)現(xiàn)在去除母鼠同類相食、流產(chǎn)、死產(chǎn)等影響因素后存活的31個后代中55%發(fā)生脊柱側(cè)凸。上述研究證明了CO環(huán)境下新生幼鼠的先天性脊柱畸形會隨生長發(fā)育成為CS。小鼠與人類發(fā)育曲線的平行性使得該動物模型對CS的研究起到了重要作用，但未來的研究中需要繼續(xù)探索CO環(huán)境暴露下發(fā)生CS的具體病理機(jī)制。

1.2 雌鼠妊娠期維生素A缺乏(vitamin A deficient，VAD)構(gòu)建CS模型 視黃酸(retinoic acid，RA)是一種活性維生素A，在細(xì)胞分化、骨軟骨發(fā)育等過程中起重要作用[13]。維生素A轉(zhuǎn)化為胚胎RA受到視黃醛脫氫酶(retinal dehydrogenase，RALDH)的嚴(yán)格調(diào)控[14]。在脊椎動物的進(jìn)化過程中RA由(RALDH1、RALDH2、RALDH3)三種RALDH合成，還可通過視黃酸受體(retinoic acid receptor，RAR)途徑對胚胎產(chǎn)生影響[15]。Li等[16]隨機(jī)將32只雌性Wistar大鼠分為對照組(常規(guī)飲食)和實(shí)驗(yàn)組(交配前給予VAD飲食，分娩后恢復(fù)常規(guī))。新生大鼠2周齡后行全脊柱X線檢查評估脊柱畸形的發(fā)生率，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)評估RALDH和RAR在椎體及肝臟中的表達(dá)。結(jié)果表明：VAD組新生大鼠CS發(fā)生率為13.79%，對照組CS發(fā)生率為0%；VAD新生大鼠在頸部、胸部、骨盆、骶尾部及四肢區(qū)域出現(xiàn)明顯骨骼畸形。VAD可負(fù)調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞及椎體中RALDH1、RALDH2、RALDH3、RAR的mRNA表達(dá)水平。Chen等[17]研究提出，內(nèi)源競爭性RNA(competitive endogenousRNA，ceRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在CS的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，對VAD誘導(dǎo)的CS形成過程中的ceRNA機(jī)制進(jìn)行全面的研究，為VAD-CS的診療提供新方式。Chen在Li等[16]的VAD-CS模型基礎(chǔ)上，隨機(jī)將20只SD雌性大鼠分為VAD實(shí)驗(yàn)組和正常對照組，造模方法同上，妊娠第9天收集兩組的胚胎進(jìn)行基因測序分析ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。提供了CS中的ceRNA數(shù)據(jù)整合分析以及非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)的綜合表達(dá)譜，全面鑒定了VAD-CS中胚胎體節(jié)發(fā)育的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。以上研究說明了母體VAD癥可導(dǎo)致子代發(fā)生CS，之后應(yīng)進(jìn)一步探索更加全面的蛋白質(zhì)組學(xué)及相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑。

2 特發(fā)性脊柱側(cè)凸(idiopathic scoliosis，IS)

IS主要表現(xiàn)為椎體的水平面旋轉(zhuǎn)、冠狀面彎曲、矢狀面異常排列的逐漸加重，約占脊柱側(cè)凸病例的84%～89%[18]。在診斷前需排除由先天性、感染性、神經(jīng)肌肉疾病以及椎管內(nèi)異常等[19]原因?qū)е碌膫?cè)凸。IS的病因?qū)W研究包括了遺傳、環(huán)境、代謝、激素、生化等[20]多個方面。目前較常見的IS鼠類模型包括下列幾種。

2.1 增強(qiáng)中樞瘦素(leptin，LP)活性構(gòu)建雙足小鼠IS模型 LP是脂肪組織分泌的一種蛋白質(zhì)類激素，對青春期下丘腦垂體系統(tǒng)、能量消耗、體重指數(shù)、骨代謝等[21]方面有一定的調(diào)節(jié)作用。Tam等[22]發(fā)現(xiàn)青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(adolescent idiopathic scoliosis，AIS)患者血清LP水平降低，LP功能障礙可能在AIS的發(fā)生發(fā)展中起相關(guān)作用。由于小鼠在LP作用系統(tǒng)方面與人類相似，所以常被用來研究LP的相關(guān)生理作用[23]。Wu等[24]將50只3周齡C3H/Hej雄性小鼠行雙前肢截骨，術(shù)后隨機(jī)分為兩組各25只，A組下丘腦注射過量表達(dá)的LP慢病毒載體，B組注射對照慢病毒載體。保持小鼠雙足直立姿勢繼續(xù)喂養(yǎng)，監(jiān)測生長狀態(tài)。20周后行X線檢查，記錄各組小鼠脊柱側(cè)凸發(fā)生率、Cobb角大小及循環(huán)血清LP含量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示：A組LP過量表達(dá)的小鼠IS發(fā)生率92%、Cobb角平均30.2°、循環(huán)血清中的瘦素含量明顯高于B組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該方法成功構(gòu)建了雙足小鼠IS模型，并證明了中樞LP活性增強(qiáng)可增加IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)并促進(jìn)疾病的進(jìn)展。但該模型與人類AIS患者仍有部分差異：A組LP過量表達(dá)的小鼠血清中LP含量升高，與AIS患者相反；A組小鼠體重在20周后與對照組無差異，與AIS患者常表現(xiàn)為體重較正常人減低不符。所以有關(guān)中樞LP活性增強(qiáng)可導(dǎo)致IS發(fā)生的具體病理機(jī)制需進(jìn)一步的研究。

2.2 利用體內(nèi)褪黑素含量減少構(gòu)建IS模型 褪黑素又稱N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是由下丘腦內(nèi)松果體分泌的一種胺類激素[25]。Thillard[26]在1959年通過切除兩足雞的松果體建立了與褪黑素含量減少相關(guān)聯(lián)的脊柱側(cè)凸動物模型，之后為研究褪黑素在IS發(fā)病過程中的作用，建立了各種誘導(dǎo)褪黑素減少導(dǎo)致IS的動物模型，其中使用最多的動物模型就是哺乳動物大鼠。Machida等[27]隨機(jī)將45只雄性SD大鼠分組，10只四足大鼠松果體切除，20只雙足大鼠松果體切除，10只雙足大鼠松果體切除后植入褪黑素顆粒，5只雙足大鼠行松果體假切除術(shù)。繼續(xù)喂養(yǎng)3個月后對大鼠行脊柱X線檢查，結(jié)果顯示脊柱側(cè)凸只出現(xiàn)在松果體切除后的雙足大鼠中，其余三組只有1只出現(xiàn)。該研究表明與人類相似的雙足站立姿勢和脊柱軸向負(fù)荷機(jī)制對脊柱側(cè)凸的發(fā)展有重要作用。Machida等[28]在之后的相似實(shí)驗(yàn)中指出，雙足大鼠松果體切除術(shù)后褪黑素缺乏所導(dǎo)致的平衡功能紊亂和雙足站立姿勢可促進(jìn)IS的發(fā)展，但松果體切除為該模型的必要條件。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)：比較各類近交系鼠，C57BL/6J小鼠的骨密度最低，因此該品系小鼠成為評價(jià)體內(nèi)褪黑素對骨形成影響的最佳選擇[29]。Machida等[30]使用C57BL/6J小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并將切除松果體的部分C57BL/6J雙足小鼠中每日規(guī)律注射褪黑素8mg/kg，5個月之后行全脊柱X線和三維CT檢查小鼠脊柱。發(fā)現(xiàn)切除松果體導(dǎo)致褪黑素缺乏癥的C57BL/6J雙足小鼠幾乎全部發(fā)生脊柱側(cè)凸，而每日注射褪黑素治療的C57BL/6J雙足小鼠未發(fā)生脊柱側(cè)凸。該實(shí)驗(yàn)證明，通過外源性的褪黑素注射療法可以有效預(yù)防脊柱側(cè)凸的發(fā)生與發(fā)展。另有研究指出，IS患者體內(nèi)褪黑素水平明顯低于同齡健康個體，表明褪黑素水平的減低與IS的發(fā)生有明顯相關(guān)性[31]。但該造模方法存在實(shí)驗(yàn)成本高、耗時長、手術(shù)難度大、實(shí)驗(yàn)鼠死亡率高等明顯不足[32]，因此之后的IS模型開始利用褪黑素拮抗劑抑制其在機(jī)體內(nèi)的作用。Yang等[32]的實(shí)驗(yàn)隨機(jī)將60只大鼠分三組，每組20只，A、B組在麻醉后行雙側(cè)前肢及尾骨近端截骨術(shù)構(gòu)建雙足大鼠模型，A、C組腹腔注射美國Sigma公司生產(chǎn)的褪黑素拮抗試劑Luzindole，注射劑量為0.2mg/kg。術(shù)后1個月、3個月、6個月分別對存活的大鼠行X線檢查并測量Cobb角。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：術(shù)后1個月時A、B兩組的脊柱側(cè)凸發(fā)生率無明顯差異，術(shù)后3個月及6個月時A組脊柱側(cè)凸發(fā)生率及Cobb角度數(shù)明顯高于B組，C組在整個過程中未出現(xiàn)脊柱側(cè)凸，該結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C組大鼠未出現(xiàn)脊柱側(cè)凸說明注射褪黑素拮抗劑可增加脊柱側(cè)凸的發(fā)病率，但單純的褪黑素抑制或缺乏不足以發(fā)生脊柱側(cè)凸，褪黑素水平降低在脊柱側(cè)凸發(fā)病過程中只發(fā)揮協(xié)同作用。該結(jié)論在Wu等[33]的實(shí)驗(yàn)中也被證實(shí)。盡管利用褪黑素缺乏可成功構(gòu)建IS模型，但褪黑素水平降低并非發(fā)生脊柱側(cè)凸的決定性因素。褪黑素相關(guān)的通路功能障礙及在人類IS發(fā)病過程中的具體作用尚未明確，且該模型體積較小，無法進(jìn)行相應(yīng)的臨床治療方面的研究。

2.3 改變大腦運(yùn)動皮質(zhì)相關(guān)信號的調(diào)控作用構(gòu)建IS模型 站立時與身體姿勢保持平衡相關(guān)的腦干組織受損后可導(dǎo)致脊柱側(cè)凸[34]。姿勢反射由本體感覺傳入調(diào)節(jié)，感覺運(yùn)動處理異?；虺霈F(xiàn)缺陷可導(dǎo)致姿勢張力受損，從而引起脊柱畸形。感覺傳入系統(tǒng)的改變可對肌張力障礙性疾病有一定影響[35]，因此單側(cè)的軸向肌張力障礙引起的異常感覺運(yùn)動與IS相關(guān)的骨骼改變有關(guān)。檢測IS部分患者的軀體感覺誘發(fā)電位可發(fā)現(xiàn)腦皮層中N-37誘發(fā)電位出現(xiàn)選擇性延遲現(xiàn)象，可能是由于本體感覺傳入系統(tǒng)的皮質(zhì)處理功能失調(diào)引起[36]。Domenech等[37]將50只Wistar大鼠隨機(jī)分為皮質(zhì)切除組24只(大腦右半球行開顱及右側(cè)皮質(zhì)電凝術(shù))，假手術(shù)組16只(只開顱不破壞右側(cè)皮質(zhì))，無干預(yù)對照組10只。術(shù)后1個月利用雙脈沖電刺激并記錄運(yùn)動誘發(fā)電位、肌電圖，術(shù)后3個月行X線檢查，Cobb法測量脊柱畸形程度。結(jié)果顯示：假手術(shù)組及對照組對雙脈沖電刺激反應(yīng)無差異、未出現(xiàn)脊柱側(cè)凸大鼠；手術(shù)組大鼠右半球興奮性明顯增強(qiáng)、左右半球明顯不對稱，46%的大鼠出現(xiàn)脊柱側(cè)凸畸形，平均Cobb角23°。通過該方法成功構(gòu)建了IS模型證明了脊柱側(cè)凸與皮質(zhì)區(qū)興奮性增強(qiáng)、感覺運(yùn)動障礙有關(guān)。兩個半球間運(yùn)動興奮性不對稱所引起的肌張力障礙可對生長發(fā)育過程中的脊柱造成一定影響，促進(jìn)脊柱側(cè)凸的發(fā)展。

2.4 無創(chuàng)方法誘導(dǎo)下構(gòu)建IS模型 Silva等[38]提出侵入性方法構(gòu)建IS模型的實(shí)驗(yàn)動物死亡率高、耗時長，易造成脊柱周圍細(xì)胞組織的改變，建議開發(fā)一種不干擾脊柱周圍組織的方法誘導(dǎo)IS模型。Silva將24只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為兩組，每組各12只。實(shí)驗(yàn)組4周齡起佩戴由聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)材料制作的背心(邊緣由合成樹脂覆蓋避免大鼠皮膚破損以及呼吸、移動受限)，持續(xù)12周。每周調(diào)整、更換PVC背心，以發(fā)展為左凸性脊柱側(cè)凸模型。每周對大鼠進(jìn)行1次全脊柱X線檢查并測量Cobb角。統(tǒng)計(jì)分析證明：佩戴PVC背心6周后，已成功構(gòu)建永久性脊柱側(cè)凸模型[Cobb角(28±5)°]。隨后收集其腹部、肋間、椎旁和兩側(cè)胸肌測定肌糖原含量，利用放射免疫法測定血漿中胰島素含量。肌糖原是機(jī)體內(nèi)重要的能源物質(zhì)，過度消耗會導(dǎo)致機(jī)體疲勞并參與肌層肥大[39]。胰島素在調(diào)節(jié)碳水化合物和骨骼肌相關(guān)激素代謝過程中有重要作用[40]。測定結(jié)果顯示：與對照組相比，發(fā)生IS的大鼠腹部肌肉、肋間肌、椎旁肌、胸肌肌糖原儲備量各減低13%、40%、20%、28%。IS大鼠的胰島素敏感性較正常對照組下降18%。Silva成功的利用無創(chuàng)誘導(dǎo)法構(gòu)建了穩(wěn)定的IS模型，發(fā)現(xiàn)了該模型中肌糖原及胰島素敏感性的變化，但該現(xiàn)象與脊柱側(cè)凸發(fā)病過程的相關(guān)生理關(guān)系仍需進(jìn)一步研究分析。

綜上所述，雖然目前針對先天性脊柱側(cè)凸、特發(fā)性脊柱側(cè)凸的手術(shù)治療規(guī)范與指南已較為成熟，但在疾病的早期預(yù)防、早期干預(yù)和病因研究方面有待進(jìn)一步發(fā)展。從解剖學(xué)、生物力學(xué)等角度來講，動物模型雖不能完全復(fù)制人類的脊柱結(jié)構(gòu)及生理狀態(tài)，但對于疾病的病因?qū)W及遺傳學(xué)方面有重要意義，為此各國學(xué)者成功構(gòu)建了各種類型的鼠類脊柱側(cè)凸動物模型。以動物模型為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)研究已成功揭示了多種脊柱側(cè)凸的相關(guān)發(fā)病機(jī)制，但是距離闡明該疾病病因的最終目標(biāo)仍有一定的距離。我們相信利用更加科學(xué)的動物模型針對脊柱側(cè)凸進(jìn)行深入的探索研究，會為將來該疾病的一級預(yù)防、發(fā)病率控制和臨床治療方面提供更有效的方法與思路。