呂國利 雷又鳴 李楊 施云飛 段晉 劉寅強 趙煒

肺癌是由多種細胞和細胞因子共同參與炎癥反應的一種惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和極高的死亡率[1]，發(fā)病機制與遺傳因素、環(huán)境因素、免疫炎癥反應等因素有關[2]。白細胞介素33(interleukin 33,IL-33)作為一種多功能因子，其位于5’端或第一內含子區(qū)的SNP位點，可結合位于細胞表面的致癌性抑制基因及相關受體復合物，介導炎癥反應和調節(jié)免疫反應，導致IL-33血清水平發(fā)生改變[3]，大量研究證實IL-33基因多態(tài)性及IL-33水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關。云南宣威是肺癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)之一[4]，至今其發(fā)病原因仍無統一共識。IL-33基因多態(tài)性及IL-33水平是否與云南宣威肺癌的易感性有關，目前尚未發(fā)現相關報道。人類基因組掃描圖譜所公布的IL-33基因rs10975521是重要SNP位點之一。因此，本研究通過分析IL-33基因rs10975521位點的多態(tài)性及血清IL-33水平與云南宣威肺癌的相關性，為云南宣威肺癌防治提供參考，現將結果報道如下。

資料與方法

一、一般資料

收集2018年5月至2019年12月在我院治療的肺癌患者作為肺癌組，納入標準：(1)經病理確診原發(fā)性肺癌新發(fā)病例；(2)未經過任何手術、放療、化療、分子靶向等治療。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)合并慢性疾病、嚴重代謝性疾病。符合納入和排除標準的患者共100例，男43例，女57例；年齡27～68歲，平均(35.89±5.23)歲。同期選取100例健康人群作為對照組，男42例，女58例；年齡26～68歲，平均(35.72±5.27)歲；既往無腫瘤病史，甲胎蛋白和癌胚抗原陰性，近期無感染史。兩組的年齡、性別等基線資料對比，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究已獲得我院倫理委員會批準同意，兩組受試者均為云南宣威籍，相互之間不存在親屬關系，所有研究對象及家屬均對本研究知情，且自愿簽署知情同意書。

二、方法

1 標本采集 于清晨抽取受試者的靜脈血2管(每管各約3mL),1管置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內，用于DNA的提??；另1管上離心機以3000r/min離心15min，提取血清，用于酶聯免疫吸附法(ELISA)測定。

2 IL-33基因多態(tài)性實驗 ①DNA提?。翰捎萌狣NA 純化試劑盒(美國Thermo Fisher公司)進行DNA 提取，紫外分光光度儀測定其含量，具體操作步驟按照說明書進行。②引物合成：委托上海天昊生物科技有限公司進行合成，rs10975521(正向引物：5′-TTGCATGCCAACAACAAGGAAC-3′，反向引物：5′-CCCCAACACCCAAATCTACACAA-3′，延伸引物：5′-TTTT-TTTTTTTGACAGTTCTGTAATCATATA-TATAGATATA-GATAA-3′)。③PCR擴增及基因測序：采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)進行擴增，PCR反應體系[樣本DNA(1.0 μL)、 PCR緩沖液(2.0 μL)、dNTPs(2.0 μL)、Taq DNA聚合酶(1.0 μL)、兩端引物(1.0 μL)、體積用滅菌雙蒸水13 ul，共20 μL]。PCR循環(huán)(95℃ 2 min、95℃ 20 s、60℃ 1 min、72℃延伸15 min)，共24個循環(huán)。延伸產物在ABI3730XL上樣并用Gene Mapper 4.1分析其基因多態(tài)性，采用測序法進一步驗證結果。

3 血清IL-33測定 采用ELISA法檢測血清中的IL-33表達水平，所用試劑盒購自上海恒遠公司，檢測者按照試劑盒操作步驟進行加樣，同時設置空白對照孔及復孔，采用酶標儀在450 mm波長下測定OD值，并在標準曲線繪制軟件下完成曲線繪制，計算出血清IL-33表達水平。

三、統計學方法

結 果

一、IL-33點位基因型頻率在肺癌組和對照組的HWE檢驗

HWE定律兩組IL-33 rs10975521G/A位點基因型檢驗顯示，觀測值與理論值的比較，均無統計學差異(P>0.05)，提示本實驗對象具備群體代表性(見表1)。

表1 IL-33點位基因型頻率在肺癌組和對照組的HWE檢驗

二、 IL-33基因rs10975521位點的基因型及等位基因頻率在各種族人群間分布

IL-33基因rs10975521的AA、GA、GG基因型及等位基因的分布頻率分別與1000 Genomes數據庫中北京漢族、日本人、歐洲人、非洲人相比較，結果發(fā)現：云南宣威IL-33基因rs10975521位點的基因型及等位基因與北京人、非洲人之間具有顯著性差異(P<0.05)，其余兩個種族無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 IL-33基因rs10975521基因型及等位基因頻率在各種族人群間分布

三、IL-33基因rs10975521基因型分布與肺癌發(fā)生風險的相關性分析

在IL-33基因rs10975521位點多態(tài)性中，肺癌組攜帶AA基因型頻率高于對照組，肺癌組與對照組的AA、GA、GG各基因頻率分布的比較，差異有統計學意義(χ2=6.066，P=0.048)。AA和GA基因型分布與GG基因型對比發(fā)現，攜帶AA基因型與增加肺癌風險具有相關性(OR=1.59，CI:1.18～3.53,P=0.016)；攜帶GA基因型與增加肺癌風險無相關性(P>0.05)。在等位基因頻率中，肺癌組A等位基因占比高于對照組，肺癌組與對照組的A、G等位基因比較，差異有統計學意義(χ2=6.193，P=0.013)。A等位基因型與G等位基因型比較，A等位基因型發(fā)生肺癌風險是G等位基因型的1.35倍(OR=135，CI: 1.25～3.97,P=0.022)(見表3)。

表3 rs10975521基因型分布與肺癌發(fā)生風險的相關性分析

四、兩組血清IL-33表達水平比較及不同基因型對IL-33水平的影響

肺癌組的血清IL-33表達水平(27.89±6.85)pg/mL明顯高于對照組的(20.13±5.97))pg/mL，差異有統計學意義(t=8.540，P<0.001)。在IL-33基因rs10975521的AA、GA、GG基因型中，肺癌組的三種不同基因型之間血清IL-33表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組的的三種不同基因型之間血清IL-33表達水平比較，無統計學意義(P>0.05)；肺癌組AA、GA基因型的IL-33表達水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組GG基因型的IL-33表達水平比較，無統計學意義(P>0.05)(見表4)。

表4 兩組血清IL-33表達水平比較及不同基因型對IL-33水平的影響

討 論

IL-33位于人類第9號染色體上，編碼270個氨基酸，是一種多態(tài)性細胞因子[5]，在機體內有雙重作用模式，對機體的穩(wěn)態(tài)維持和對外界環(huán)境變化的應答十分重要。云南宣威地區(qū)是我國肺癌的點狀高發(fā)區(qū)，研究當地肺癌發(fā)病機制已成為熱點和難點。探究IL-33基因多態(tài)性及其血清水平與宣威肺癌的關系，可為宣威肺癌的分子生物學角度來分析該疾病的發(fā)生與轉歸，為臨床治療提供參考。

IL-33是一種前炎性細胞因子，可結合白介素1(interleukin 1,IL-1)受體家族成員孤兒受體 ST2，誘導Th2細胞的生成，介導免疫和炎癥反應[6]。IL-33還是一種“預警因子”，細胞壞死時，IL-33可從細胞核中釋放，進而刺激多種炎癥因子參與免疫調控[7]。IL-33基因多態(tài)性的分布特點因地域、種族、環(huán)境、自然等存在著很大差異[8]。本研究發(fā)現云南宣威人IL-33基因rs10975521位點分別為AA、GA、GG三種，頻率分別為19.00%、48.00%、33.00%，通過與1000Genomes數據庫結果比較，也發(fā)現IL-33基因rs10975521位點無論是基因型還是等位基因頻率，與不同種族、不同地區(qū)人群均存在差別?；蚨鄳B(tài)性是一種普遍存在的現象，這種突變與環(huán)境有很大關系。宣威地區(qū)地處云南東北部, 擁有豐富的煤炭資源，大多數宣威居民在通風不良的家中燒黑煙(煙煤)做飯、取暖，整個生活過程都暴露在極高水平的多環(huán)芳烴(PAHs)下，這可能也是宣威人高發(fā)肺癌的關鍵因素。有研究表明，IL-33在胃癌、乳腺癌等多種系統腫瘤中起關鍵性炎癥因子作用，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[9-12]。本研究對IL-33基因多態(tài)性與云南宣威肺癌的相關性分析發(fā)現，肺癌組在IL-33基因rs10975521位點基因型及等位基因頻率的分布和對照組之間的比較有顯著性差異，攜帶AA基因型與增加肺癌風險具有顯著的相關性，其中A等位基因型發(fā)生肺癌風險是G等位基因型的1.35倍?？赡苁茄装Y環(huán)境介導IL-33釋放, 由此經IL-33基因多態(tài)性rs10975521位點及ST2受體和其下游信號通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Mousas A等[13]研究表明，IL-33基因rs146597587與嗜酸性粒細胞計數的減少存在關系。這可能解釋了炎癥介導IL-33釋放。

IL-33可通過調節(jié)Th2細胞的分化，進而促進炎癥因子的釋放，加重機體炎癥反應，促使肺癌患者的肺功能下降。大量研究報道，IL-33在多種慢性炎癥(如肝纖維化、炎癥性腸病等)及癌前病變(如宮頸上皮內瘤變、腸腺瘤等)均呈高表達[14-16]。均提示了IL-33可能在炎癥向腫瘤發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用。Hu等[17]研究證實非小細胞肺癌病人血清中較高的IL-33水平與不良預后有關。本研究發(fā)現肺癌組的血清IL-33表達水平明顯高于對照組(P<0.05)。與Kim等[18]研究報道肺癌病人血清中IL-33表達水平高于正常人的結果相符，表明肺癌的發(fā)生發(fā)展與IL-33的介導有關。其原因分析：IL-33與其受體ST2結合，刺激下游信號分子聚集，誘導Th2細胞IL-1、IL-8分泌，促進炎癥反應，導致Th1/Th2失衡。而Th1/Th2失衡可誘發(fā)肺癌[19-21]。因此，血清IL-33表達也屬于誘導型。本研究還發(fā)現在IL-33基因rs10975521的AA、GA、GG基因型中，肺癌組的三種不同基因型之間血清IL-33表達水平比較有差異，且血清IL-33表達水平在rs10975521的AA、GA、GG基因型為AA>GA>GG。rs1929992-AA位于IL-33基因內含子區(qū)，不太可能改變蛋白質的核心構象，但可能影響其與受體結合的親和力，當rs1929992突變表現為AA基因型時，其位點的突變對轉錄活性產生了影響，同時也影響基因調控和功能[22], 導致rs10975521位點表現為AA時肺癌易感性高。血清IL-33表達是誘導型，rs10975521位點表現為AA增加肺癌易感性，肺部正常細胞壞死，會增高血清IL-33表達水平，因為IL-33可在壞死細胞核中釋放出。這也提示了肺癌患者血清IL-33高表達水平很可能是受rs10975521位點表現為AA基因型的介導。

綜上所述，IL-33基因rs10975521位點多態(tài)性與云南宣威肺癌易感性具有相關性，其中rs10975521位點表現為AA時可促進血清IL-33的高表達，與云南宣威肺癌發(fā)生風險相關。

本研究因局限的實驗樣本量，結果可能存在一定偏倚，仍需更大的樣本量來進一步佐證。