蘇甲林 趙參軍 鄭瑾

肺癌是目前最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率都位居前列，且仍然呈上升趨勢(shì)[1-2]。其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌約85%，而肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌最常見(jiàn)的亞型[3]。盡管非小細(xì)胞肺癌在早期診斷、預(yù)防和治療上有所改善，但是，在過(guò)去幾十年中各階段非小細(xì)胞肺癌的5年總生存率并沒(méi)有顯著改變[4-5]。目前，外科手術(shù)、化放療、分子靶向治療和免疫治療等方法已廣泛應(yīng)用于肺癌，并取得了較好的療效[6-10]。但對(duì)于無(wú)手術(shù)、放療適應(yīng)癥、化療耐藥及出現(xiàn)無(wú)法耐受毒副作用的患者，中醫(yī)藥有一定的優(yōu)勢(shì)，其對(duì)于調(diào)整機(jī)體整體平衡，改善放、化療治療的毒副反應(yīng)，提高患者生存時(shí)間和生存質(zhì)量具有重要意義[11-12]。土貝母是我國(guó)一種傳統(tǒng)中藥，以鱗莖入藥，性味苦，畏寒，歸肺、脾經(jīng)，有散結(jié)、消腫、解毒之功效[13-14]。研究人員利用多種色譜分離手段，分離土貝母根莖得到了30種化合物[13, 15]。土貝母中皂苷占比例較大，也是主要的活性成分之一，其中，土貝母苷甲(Tubeimoside-1，TBMS1)是一種聚完三萜皂苷，具有良好的水溶性[11, 16]。體外實(shí)驗(yàn)研究顯示土貝母苷甲對(duì)多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)均有明顯的抑制效果[14, 17-18]。本實(shí)驗(yàn)以土貝母苷甲為主要研究對(duì)象，MTS法觀(guān)察土貝母苷甲對(duì)人肺腺癌細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制作用，使用流式細(xì)胞儀觀(guān)察土貝母苷甲對(duì)A549細(xì)胞周期及凋亡變化，Western blot 檢測(cè)土貝母苷甲對(duì)Caspase通路蛋白表達(dá)變化，探討土貝母苷甲對(duì)人肺腺癌細(xì)胞的增殖及凋亡作用，為進(jìn)一步研究土貝母苷甲治療肺腺癌的臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

資料與方法

一、材料

人肺腺癌細(xì)胞株(A549)購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)，F(xiàn)-12K Nutrient Mixture 培養(yǎng)基(F-12K)、胎牛血清、胰酶均購(gòu)自Gibco公司；MTS購(gòu)自美國(guó)promega公司；Annexin V-FITC和Propidium Iodide購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；無(wú)菌操作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱，低溫高速離心機(jī)和酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；用于Western blot的caspase-9、caspase-3、PARP抗體夠自美國(guó) Cell Signaling Technology公司，山羊抗小鼠二抗 、DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒(P0202)、RIPA裂解液(P0013)、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(P0061)購(gòu)于碧云天公司。土貝母苷甲購(gòu)自天津一方科技有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1 土貝母苷甲母液配制

用天平稱(chēng)取土貝母苷甲10 mg溶解5 mL已滅菌的PBS溶液中，待完全溶解后用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺腺癌細(xì)胞A549用含10%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基于5% CO2，37℃恒溫培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞均勻分布，每?jī)商旄鼡Q新鮮培養(yǎng)基一次，待細(xì)胞融合度達(dá)到約90%時(shí)按1 ∶3進(jìn)行傳代。

三、體外抗腫瘤活性測(cè)定

1 MTS法測(cè)定土貝母苷甲對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以1 000個(gè)細(xì)胞每孔接種到96孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，更換培養(yǎng)基，并在新的培養(yǎng)基中按照下列濃度為終濃度加入土貝母苷甲儲(chǔ)液(μg/mL)：0、1、2、5。每組設(shè)立3個(gè)重復(fù)孔，并設(shè)立空白孔；隔天更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)4天，維持土貝母苷甲濃度，每天固定時(shí)間點(diǎn)取出1個(gè)96孔板，每孔加入20μl MTS試劑，并置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度值(OD值)。

2 土貝母苷甲對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549周期分布的影響

采用流式細(xì)胞儀結(jié)合PI染劑檢測(cè)分析各組細(xì)胞周期的變化：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以2×105個(gè)細(xì)胞每孔種至6孔板中；使用含1 μg/mL土貝母苷甲培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞48 h后作為處理組，對(duì)照組加入培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；使用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化兩組細(xì)胞并收集于離心管中。將細(xì)胞于20℃，2 000 rpm離心5 min后，用預(yù)冷的PBS離心洗滌細(xì)胞，4℃，2 000 rpm，離心5 min，加入預(yù)冷的75%乙醇溶液于4℃冰箱中過(guò)夜固定；將細(xì)胞再次用預(yù)冷的PBS溶液洗滌離心后，將細(xì)胞重懸于含50 μg/mL的PI染劑和50 μg/mL的RNase A溶液中，置入37℃水浴箱中孵育約30 min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期的檢測(cè)。

3 土貝母苷甲對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549凋亡率的影響

采用流式細(xì)胞儀結(jié)合Annexin FITC凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以2×105個(gè)細(xì)胞每孔種至6孔板中；使用含1 μg/mL土貝母苷甲培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞48 h后作為處理組，對(duì)照組加入培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；分別取1 mL細(xì)胞懸液用預(yù)冷的PBS離心洗滌細(xì)胞，4℃，2 000 rpm，離心5 min，共3次，棄去上清液；加入500 μL Annexin FITC及APC試劑并混勻后加入5 μL PI試劑并混勻，于室溫下避光孵育15～20 min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)；結(jié)果判斷：在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左上象限代表收集過(guò)程中出現(xiàn)的損傷細(xì)胞，右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，左下象限代表正常存活細(xì)胞，右下象限代表早期凋亡細(xì)胞。以早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞之和為凋亡的細(xì)胞。

4 Western blot 檢測(cè)土貝母苷甲對(duì)Caspase通路蛋白表達(dá)

將兩組細(xì)胞接種至60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用含1 μg/mL土貝母苷甲培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞48 h后作為處理組，對(duì)照組加入培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；收集兩組細(xì)胞蛋白質(zhì)，進(jìn)行Western blot檢測(cè)Caspase-9、Caspase-3和Parp在兩組細(xì)胞中的表達(dá)情況。

四、統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS Statistics 23對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)分析，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，多組之間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)的方法P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、土貝母苷甲對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

利用MTS法檢測(cè)土貝母苷甲對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，結(jié)果顯示，各組細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間的推移都呈現(xiàn)出增殖的趨勢(shì)，隨著土貝母苷甲濃度的增加，A549細(xì)胞的增殖能力顯著降低(P<0.05)，提示土貝母苷甲對(duì)A549細(xì)胞的增殖具有抑制作用(圖1)。

圖1 土貝母苷甲對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響，*P<0.05

二、土貝母苷甲對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549周期分布的影響

通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)土貝母苷甲對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549周期分布的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 1 ug/mL土貝母苷甲處理A549細(xì)胞48 h后比對(duì)照組A549細(xì)胞 G0/G1期百分率顯著增加(P<0.05)。同時(shí)，處理組細(xì)胞的S期百分率比對(duì)照組A549細(xì)胞顯著降低(P<0.05)。表明土貝母苷甲處理A549細(xì)胞48 h后，A549細(xì)胞更多的阻滯于G0/G1期，提示土貝母苷甲抑制人肺腺癌細(xì)胞增殖(圖2)。

圖2 土貝母苷甲對(duì)A549細(xì)胞周期分布的影響

三、土貝母苷甲對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549凋亡水平的影響

通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)土貝母苷甲對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549凋亡水平的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：1 ug/mL土貝母苷甲處理A549細(xì)胞48 h后比對(duì)照組A549細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。表明土貝母苷甲處理A549細(xì)胞48 h后，A549細(xì)胞凋亡率顯著增高，提示土貝母苷甲促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞凋亡(圖3)。

圖3 土貝母苷甲對(duì)A549細(xì)胞凋亡率的影響

四、Western blot檢測(cè)土貝母苷甲對(duì)Caspase通路蛋白表達(dá)差異

將細(xì)胞重新接種至60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，提取總蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，以GAPDH作為內(nèi)參，分析土貝母苷甲對(duì)A549細(xì)胞Caspase-9、Caspase-3和Parp表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：處理組比對(duì)照組的cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3和cleaved Parp的表達(dá)顯著增加(P<0.05)，表明土貝母苷甲可通過(guò)Caspase通路引起細(xì)胞凋亡(圖4)。

圖4 土貝母苷甲對(duì)A549細(xì)胞Caspase-9、Caspase-3和Parp表達(dá)的影響

討 論

近年來(lái)，中醫(yī)藥在腫瘤防治中以其確切的療效倍受人們關(guān)注。肺癌位居癌癥之首，但其治療效果仍不理想。目前，肺癌仍然是全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤和最常見(jiàn)的癌癥死亡原因，分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌兩種主要組織學(xué)類(lèi)型。非小細(xì)胞肺癌是最常見(jiàn)的肺癌類(lèi)型，其中腺癌占大多數(shù)[19]。研究發(fā)現(xiàn)土貝母苷甲在抗炎、抗病毒和免疫抑制效應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的生物作用[20]。此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明土貝母苷甲具有顯著的抗腫瘤作用，如抑制細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)人肝癌、食管鱗狀細(xì)胞癌和絨毛膜癌等癌細(xì)胞凋亡[21-22]，在乳腺癌、結(jié)腸癌中也具有抑制腫瘤生長(zhǎng)作用[23]。為了探索土貝母苷甲在治療肺癌中的作用，我們選擇人肺腺癌A549細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用MTS法檢測(cè)土貝母苷甲對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響，隨著土貝母苷甲濃度的增加，A549細(xì)胞的增殖能力顯著降低，提示土貝母苷甲對(duì)A549細(xì)胞的增殖具有抑制作用。

通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)是腫瘤治療的主要策略。因此，我們對(duì)土貝母苷甲處理A549細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分析。凋亡誘導(dǎo)是阻礙腫瘤生長(zhǎng)和增殖的主要機(jī)制之一。凋亡是細(xì)胞程序性死亡的過(guò)程，用于從體內(nèi)去除不需要的細(xì)胞而不引起炎癥。凋亡途徑中的缺陷與腫瘤的發(fā)展有關(guān)，并且可能導(dǎo)致腫瘤對(duì)化療的抗藥性。我們通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)土貝母苷甲對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549凋亡水平的影響，發(fā)現(xiàn)土貝母苷甲處理A549細(xì)胞48 h后，A549細(xì)胞凋亡率顯著增高。胱天蛋白酶在程序性細(xì)胞死亡的起始和執(zhí)行中起關(guān)鍵作用，Caspase-3、 Caspase-9和Parp是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，負(fù)責(zé)結(jié)構(gòu)和信號(hào)蛋白的蛋白水解降解，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。為了進(jìn)一步確定土貝母苷甲誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低是否與細(xì)胞凋亡相關(guān)，我們采用Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞中的Caspase-3、Caspase-9和Parp蛋白活性水平。我們發(fā)現(xiàn)土貝母苷甲處理A549細(xì)胞導(dǎo)致Caspase-3、Caspase-9和Parp活性水平顯著增加，表明土貝母苷甲可通過(guò)Caspase通路引起細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞周期停滯是抑制細(xì)胞增殖的重要信號(hào)。此外，凋亡的誘導(dǎo)可能通過(guò)細(xì)胞周期停滯來(lái)介導(dǎo)。為了確定土貝母苷甲是否由于誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯而抑制了癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，我們研究了土貝母苷甲對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的影響。使用流式細(xì)胞儀分析表明，土貝母苷甲處理A549細(xì)胞后G0/G1期細(xì)胞百分率顯著增加，同時(shí)，S期細(xì)胞百分率顯著降低。提示土貝母苷甲通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期抑制人肺腺癌細(xì)胞增殖。

以上研究已證實(shí)土貝母苷甲具有抗腫瘤作用，土貝母苷甲抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。發(fā)現(xiàn)土貝母苷甲處理A549細(xì)胞48 h后細(xì)胞增殖速度顯著下降，并使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)土貝母苷甲處理A549細(xì)胞48 h后使細(xì)胞阻滯在G0/G1期，而抑制細(xì)胞增殖且促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞發(fā)現(xiàn)土貝母苷甲可通過(guò)Caspase通路引起細(xì)胞凋亡。綜上所述，土貝母苷甲在抑制肺腺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用，為土貝母苷甲在后期不同病理類(lèi)型的肺癌治療提供理論依據(jù)，并為肺腺癌的治療提供新的視野。