余艷芳 趙開(kāi)順 屠春林 陳娓 梁海鷹 易清清

2019年世界結(jié)核報(bào)告顯示，2018年全球結(jié)核潛伏感染人群占全人群的1/4左右(感染人群高達(dá)約17億)，其中結(jié)核新發(fā)病例近1 000萬(wàn)，其中中國(guó)新發(fā)結(jié)核患者86.6萬(wàn)；報(bào)告顯示我國(guó)58%初診結(jié)核病例(細(xì)菌學(xué)上確認(rèn))對(duì)利福平耐藥，復(fù)診患者(有治療經(jīng)歷的患者)100%耐利福平，耐藥結(jié)核病(drug-resistant tuberculosis, DR-TB)尤其是耐多藥結(jié)核病(multidrug- resistant tuberculosis, MDR-TB)是嚴(yán)重影響中國(guó)乃至世界的公共衛(wèi)生難題[1]。吡嗪酰胺、乙胺丁醇作為一線口服類(lèi)抗結(jié)核藥物，其藥敏結(jié)果均存在不夠準(zhǔn)確性，且吡嗪酰胺在耐多藥、廣泛耐藥結(jié)核病中的耐藥率較高，臨床上對(duì)于復(fù)診患者(有治療經(jīng)歷的患者)應(yīng)謹(jǐn)慎使用[2-3]。WHO強(qiáng)調(diào)，在治療耐藥結(jié)核病的強(qiáng)化期均使用一種二線注射類(lèi)藥物，其中氟喹諾酮類(lèi)藥物是治療耐多藥結(jié)核病最有效的藥物，并能夠用于不耐受現(xiàn)有一線抗結(jié)核藥物的患者[4-5]。臨床藥敏試驗(yàn)是檢測(cè)結(jié)核耐藥的臨床金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)久，導(dǎo)致的診斷延遲無(wú)論對(duì)于患者本身的治療，還是控制耐藥結(jié)核菌的傳播，都是十分不利的[6]。對(duì)于結(jié)核患者的耐藥檢測(cè)，臨床上迫切需要一種快速、準(zhǔn)確的手段，減小延遲診斷導(dǎo)致的不良影響,由于耐結(jié)核藥物的臨床菌株的分子機(jī)制目前尚不完全明確，因此，分子生物學(xué)手段可作為傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)的補(bǔ)充，不能完全代替藥敏檢測(cè)技術(shù)來(lái)鑒定臨床菌株的耐藥性[7-9]。

核酸飛行質(zhì)譜檢測(cè)平臺(tái)是復(fù)雜生物樣品中痕量核酸進(jìn)行全方位研究的技術(shù)平臺(tái)，具有通量高、檢測(cè)速度快、成本低的特點(diǎn)[10]，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)于2014年批準(zhǔn)MALDI-TOF MS可用于臨床核酸檢測(cè)，該技術(shù)其檢測(cè)效率、檢測(cè)通量均遠(yuǎn)高于熒光定量PCR檢測(cè)，而檢測(cè)周期又遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的一代測(cè)序和二代測(cè)序(≥18h)，少量的臨床標(biāo)本也可進(jìn)行多基因多位點(diǎn)的檢測(cè)[11-12]，可極大程度的滿足臨床檢測(cè)的需求。本研究基于MassARRAY核酸飛行質(zhì)譜檢測(cè)平臺(tái)，分析復(fù)治患者(有治療經(jīng)歷的患者)抗結(jié)核藥物異煙肼、氟喹諾酮類(lèi)藥物(左氧氟沙星、莫西沙星)和二線注射類(lèi)藥物(阿米卡星、卷曲霉素)的耐藥性，并與臨床藥敏測(cè)試結(jié)果對(duì)比，為建立快速準(zhǔn)確的鑒定結(jié)核患者耐藥的分子檢測(cè)技術(shù)奠定一定的基礎(chǔ)。

資料與方法

一、一般材料

收集2016年1月-2019年6月上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院肺科肺結(jié)核復(fù)診患者(有治療經(jīng)歷的患者)的菌培養(yǎng)樣本55例，最低抑菌濃度法(minimum inhibitory concentration， MIC)[13-14]鑒定為臨床耐藥的樣本45例，其中異煙肼和氟喹諾酮類(lèi)耐藥45例，二線注射類(lèi)耐藥23例，藥物敏感樣本10例。結(jié)核病患者中男性患者44例，女性患者11例，年齡范圍35～64歲，平均年齡47歲。培養(yǎng)其菌液樣本，提取DNA，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

二、儀器與試劑

1 儀器

潔凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州安泰技術(shù)有限公司(中國(guó)，VD-650-U)，PCR儀購(gòu)自Eppendorf(德國(guó))，板式離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf(德國(guó)，5804R)，去離子水儀購(gòu)自上海舟技化工科技有限公司(中國(guó)，EasyQ-A0.5)，Hula翻轉(zhuǎn)搖勻儀購(gòu)自其林貝爾儀器制造有限公司(中國(guó)， BQ-210)，MassARRAY? RS1000 Nanodispenser購(gòu)自Agean公司(美國(guó)，63008)，MassARRY? Analyzer 4 System-96購(gòu)自Agena公司(美國(guó)， 63010)。

2 試劑

Complete iplex pro genotyping reagent購(gòu)自Agena(美國(guó)，10160)，PCR引物和UEP探針購(gòu)自Genscript(中國(guó))，菌株提取試劑盒購(gòu)自寧波重鼎(中國(guó)，ZD-TG-08-100)。

三、方法

1 臨床耐藥菌株培養(yǎng)和提取

用最低抑菌濃度法(minimum inhibitory concentration， MIC)鑒定為MTB臨床耐藥的樣本45例，藥物敏感樣本10例，取其痰液2 mL，用2.94%和枸櫞酸鈉溶液和4%的NaOH溶液(用之前加0.5 g NALC)混合的溶液進(jìn)行液化，振蕩30s，如果樣本粘稠，可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間，室溫(20℃～25℃)放置15 min，加入1/15 M PBS緩沖液20 mL，混勻，以3 000 g離心20～30 min，傾去上清液，加入1/15 M PBS緩沖液0.5 mL，混勻后接種于培養(yǎng)基中。接種的培養(yǎng)基在37℃孵育。培養(yǎng)后的菌株，提取菌液基因組DNA。MIC的臨床耐藥標(biāo)準(zhǔn)按照前人的研究中為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀[13]。本實(shí)驗(yàn)采用重鼎試劑盒提取結(jié)核分枝桿菌菌株基因組DNA。

2 耐藥相關(guān)位點(diǎn)引物和單堿基延伸引物(unextended extend primer,UEP)設(shè)計(jì)

表1 質(zhì)譜檢測(cè)耐藥位點(diǎn)與藥物

MALDI-TOF MS其檢測(cè)原理為：基于多重PCR，檢測(cè)標(biāo)本經(jīng)普通PCR引物(多重)擴(kuò)增后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)蝦堿性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase,SAP)去除PCR產(chǎn)物中的脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate, dNTP)，純化后的產(chǎn)物在加入雙脫氧核苷三磷酸(dideoxy-ribonucleoside triphosphate, ddDNP)的體系中，經(jīng)特異的單堿基延伸引物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，1個(gè)反應(yīng)管可同時(shí)檢測(cè)高達(dá)40個(gè)SNP位點(diǎn)，且無(wú)需熒光標(biāo)記[11]，將所獲得的延伸產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至特制的芯片上并進(jìn)行質(zhì)譜分析。根據(jù)此原理，結(jié)合前人研究，針對(duì)異煙肼、氟喹諾酮類(lèi)和二線注射類(lèi)的阿米卡星、卷曲霉素耐藥相關(guān)位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)表2)和UEP(見(jiàn)表3)，檢測(cè)涵蓋耐藥相關(guān)的6個(gè)基因的14個(gè)位點(diǎn)，利用MassARRAY? Assay Design Suite(Agena)進(jìn)行設(shè)計(jì)引物和UEP設(shè)計(jì)。

表2 核酸飛行質(zhì)譜檢測(cè)位點(diǎn)擴(kuò)增引物表

表3 核酸飛行質(zhì)譜檢測(cè)突變位點(diǎn)單堿基延伸序列表

3 核酸質(zhì)譜檢測(cè)耐藥位點(diǎn)的突變與一代測(cè)序驗(yàn)證

提取后的基因組DNA用于核酸質(zhì)譜檢測(cè)，檢測(cè)方法概括為：配置反應(yīng)液5 μL，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 2分鐘，(95℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 60秒)45個(gè)循環(huán)，72℃ 5分鐘；擴(kuò)增后的產(chǎn)物取5 μL加入2 μL的SAP酶和緩沖液的混合溶液進(jìn)行dNTP和多余引物的去除，程序?yàn)?7℃ 40分鐘，85℃ 5分鐘；再加入2 μL的單堿基反應(yīng)液(UEP反應(yīng)液)2 μL進(jìn)行檢測(cè)位點(diǎn)的單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 30秒，(94℃ 5秒，52℃ 5秒，80℃ 5秒)40個(gè)循環(huán)，72℃ 3分鐘；將反應(yīng)液中加入適量潔凈樹(shù)脂，在Hula翻轉(zhuǎn)搖勻30分鐘；將96孔板離心10分鐘，在MassARRAY? RS1000 Nanodispenser上點(diǎn)樣到芯片，將芯片在MassARRY? Analyzer 4 System-96上打質(zhì)譜。將質(zhì)譜檢測(cè)位點(diǎn)涉及的區(qū)域PCR擴(kuò)增并用一代測(cè)序檢測(cè)該區(qū)域突變，比對(duì)與質(zhì)譜檢測(cè)一致性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以一代測(cè)序和MIC方法檢測(cè)的突變和臨床耐藥為金標(biāo)準(zhǔn)，敏感度計(jì)算方法為真陽(yáng)性數(shù)/(真陽(yáng)性數(shù)+假陰性數(shù))×100%；特異性計(jì)算方法為真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù))×100%；符合率計(jì)算方法為[(真陽(yáng)性數(shù)+真陰性數(shù))/檢測(cè)總數(shù)]×100%。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，Kappa≥0.75認(rèn)為一致性良好，Kappa在0.4～0.75之間認(rèn)為一致性一般，Kappa<0.4認(rèn)為一致性較差。[15]

結(jié) 果

一、臨床耐藥菌株培養(yǎng)和提取

將MIC方法鑒定為耐藥的菌株分離，培養(yǎng)后提取，耐藥培養(yǎng)結(jié)果和提取濃度結(jié)果(見(jiàn)表4)。

表4 耐藥菌株MIC結(jié)果

二、核酸質(zhì)譜基因突變檢測(cè)與一代測(cè)序突變檢測(cè)結(jié)果比較

目前，單核苷酸多態(tài)性(SNP)的金標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證技術(shù)為Sanger測(cè)序技術(shù)[16]，，本研究中55株臨床菌株樣本的核酸質(zhì)譜檢測(cè)與一代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)表5)，其中檢測(cè)異煙肼的耐藥突變靈敏度為100%(37/37)，特異性為100%(18/18)；檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)的耐藥突變靈敏度為100%(34/34)，特異性為100%(21/21)；檢測(cè)二線注射類(lèi)的耐藥突變靈敏度為100%(10/10)，特異性為(45/45)?？傮w核酸質(zhì)譜檢測(cè)與一代測(cè)序檢測(cè)一致率100%，一致性檢驗(yàn)Kappa值為1。表明質(zhì)譜檢測(cè)耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)的準(zhǔn)確性與金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法一致，而相比一代測(cè)序，核酸質(zhì)譜檢測(cè)更加快速，操作簡(jiǎn)便。

表5 55例MTB菌株核酸質(zhì)譜耐藥突變與一代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果比較

三、核酸質(zhì)譜基因型藥敏試驗(yàn)與表型藥敏試驗(yàn)對(duì)比結(jié)果

質(zhì)譜檢測(cè)基因型藥敏與臨床表型藥敏的比對(duì)結(jié)果(見(jiàn)表2～3)。在45株異煙肼耐藥菌株中，質(zhì)譜檢測(cè)含耐藥突變的菌株有37例，檢測(cè)靈敏度為82.2%(37/45)，特異性為分別為100%(10/10)；在45株氟喹諾酮類(lèi)耐藥菌株中，質(zhì)譜檢測(cè)含耐藥突變的菌株有34例，檢測(cè)靈敏度為75.6%(34/45)，特異性為100%(10/10)；在臨床藥敏檢測(cè)的23株二線藥耐藥株中，質(zhì)譜檢測(cè)含耐藥突變的菌株有10例，全部為rrs基因1401 A→G的突變，檢測(cè)靈敏度為45.5%(10/22)，特異性為100%(33/33)。兩種方法的總一致率為89.1%，一致性檢驗(yàn)Kappa值為0.703。

四、常見(jiàn)突變位點(diǎn)的分析

在45株異煙肼耐藥菌株中，KatG基因的315密碼子AGC→ACC為最常見(jiàn)突變，有36例(97.3%，36/37)，其中有12例樣本含有inhA-promoter的雙突變，且含雙突變的樣本，其臨床MIC檢測(cè)耐藥性更強(qiáng)(MIC≥8)。在45株氟喹諾酮耐藥菌株中，gyrA基因94密碼子GAC→GGC為最常見(jiàn)突變位點(diǎn)，有15例(44.1%，15/34)，與gyrA基因相關(guān)的突變樣本有32例(包含一代測(cè)序檢測(cè)出的突變樣本)。Y198、Y 47、Y 49、Y 51、Y 63樣本含有兩個(gè)突變，其臨床MIC檢測(cè)耐藥性更強(qiáng)(MIC≥16)。在臨床藥敏檢測(cè)的23株二線藥耐藥株中，質(zhì)譜檢測(cè)含耐藥突變的菌株有10例，全部為rrs基因1401 A→G的突變。臨床檢測(cè)靈敏度與前人研究存在較大差異。

討 論

本研究中核酸質(zhì)譜檢測(cè)基因變異與一代測(cè)序具有良好的一致性，并且在預(yù)測(cè)MTB菌株耐藥方面具有一定的一致性，可同時(shí)預(yù)測(cè)多種藥物的耐藥性，由于檢測(cè)法需8h獲得結(jié)果(其手工操作時(shí)間<30min)，1個(gè)反應(yīng)管可同時(shí)檢測(cè)高達(dá)40個(gè)SNP位點(diǎn)，使其檢測(cè)效率、檢測(cè)通量均遠(yuǎn)高于熒光定量PCR檢測(cè)，而檢測(cè)周期又遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的一代測(cè)序和二代測(cè)序(≥18 h)，少量的臨床樣本也可進(jìn)行多基因多位點(diǎn)的檢測(cè)，可極大程度的滿足臨床檢測(cè)的需求[12]。

表6 55例MTB菌株核酸質(zhì)譜基因型藥敏試驗(yàn)與表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較

研究發(fā)現(xiàn)，超過(guò)80%的異煙肼耐藥與KatG基因及inhA 基因突變相關(guān)，本研究用一代測(cè)序?qū)atG基因和inhA基因的突變熱點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)本研究耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)中不包含的katG基因315位密碼子AGC→ACG和inhA 基因promoter(-34)C→T兩個(gè)突變位點(diǎn)，而在其他的研究中，這兩個(gè)位點(diǎn)的突變發(fā)生頻率很低[17]；氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥與gyrA基因和gyrB基因突變相關(guān)，gyrA基因耐藥決定區(qū)(quinolone resistance determining region, QRDR)發(fā)生 突變可以解釋60%～90%的菌株耐藥，且gyrA基因和gyrB基因雙突變的菌株表現(xiàn)為高水平的耐藥[18-19]，本研究與前人的研究相符。Ruiru Shi[20]等人，研究顯示gyrA雙點(diǎn)突變報(bào)道較多，其研究中有56%的臨床菌株存在gyrA基因雙突變，Avalos E[19]等人研究顯示，僅1%～3%的耐藥菌中存在 gyrA 基因雙突變，本研究總共31例在gyrA基因突變的菌株中(包含一代測(cè)序結(jié)果)，含2株(6.25%，2/32)gyrA雙點(diǎn)突變株，可能與各研究中不同的檢測(cè)方法和檢測(cè)區(qū)域有關(guān)，也可能與不同區(qū)域的菌株本身突變特性相關(guān)。本研究用一代測(cè)序方法篩查gyrA基因和gyrB基因的序列，發(fā)現(xiàn)gyrA基因的(70位密碼子CAC→CGC)和gyrB基因的(539位密碼子ACC→GCC、543位密碼子GCG→ACG、551位密碼子GGG→AGG)突變型均不在喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥決定區(qū)，是值得關(guān)注的耐藥突變相關(guān)位點(diǎn)。

本研究中二線注射類(lèi)藥物的靈敏度為45.5%，與前人研究結(jié)果差異較大，總結(jié)國(guó)內(nèi)外部分研究發(fā)現(xiàn)[21-22]，通過(guò)該位點(diǎn)的突變檢測(cè)結(jié)核菌株耐藥的靈敏度從1.8%～100%范圍內(nèi)不等，其中在中國(guó)人群中，靈敏度從50.6%～86.4%不等。由于本研究所有檢測(cè)標(biāo)本均進(jìn)行一代測(cè)序驗(yàn)證檢測(cè)，且驗(yàn)證結(jié)果和核酸質(zhì)譜多重檢測(cè)結(jié)果一致，因此可排除由于多重PCR設(shè)計(jì)導(dǎo)致引物間相互作用致使其檢測(cè)不到耐藥突變，因此，推斷二線注射類(lèi)藥物靈敏度低可能是本研究中二線注射類(lèi)耐藥患者納入的臨床研究標(biāo)本相對(duì)較少，也可能由于設(shè)計(jì)涉及的耐藥突變位點(diǎn)(rrs基因A1401G)與臨床耐藥存在地域性差別，或者是該類(lèi)菌株存在其他耐藥位點(diǎn)或其他耐藥機(jī)制，這擴(kuò)大研究標(biāo)本量和擴(kuò)大突變檢測(cè)區(qū)域進(jìn)行更進(jìn)一步的驗(yàn)證。