褚保鳳 底建輝 方強(qiáng) 張麗 馬婷婷

哮喘是多種細(xì)胞及其組分參與的慢性非特異性炎癥性疾病，多發(fā)病于兒童。威脅兒童健康的最常見(jiàn)的慢性哮喘的發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，該病具體的發(fā)病機(jī)制還不明確[1]。氣道炎癥和氣道重塑是該病的兩個(gè)主要病理特征，過(guò)度的炎癥因子表達(dá)與黏液分泌會(huì)導(dǎo)致氣道阻塞，也會(huì)導(dǎo)致上皮杯狀細(xì)胞增生/化生和黏膜下腺體增生肥大，從而在臨床上表現(xiàn)為氣道上皮纖維化、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等癥狀[2]?，F(xiàn)代研究表明哮喘是一種免疫失衡性疾病，Th1/Th2平衡失調(diào)被認(rèn)為是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制，其中Th2釋放IL-6、TNF-α等促炎癥因子可致哮喘發(fā)病，IL-4、IL-13等抑炎癥因子可以促使B細(xì)胞合成IgE，拮抗Th2細(xì)胞反應(yīng)，抑制哮喘發(fā)病[3-4]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducers and activators of transcription，STAT)是一類(lèi)能與靶基因調(diào)控區(qū)結(jié)合的胞漿蛋白家族，其與酪氨酸磷酸化信號(hào)偶聯(lián)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[5]；當(dāng)前研究顯示STAT6在肺組織中的表達(dá)顯著高于其他器官，其能調(diào)控許多不同的生理過(guò)程，比如炎癥因子釋放、應(yīng)激反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄沉默、染色質(zhì)穩(wěn)定性、細(xì)胞周期、凋亡、自噬、生長(zhǎng)抑制等[6]。半乳糖凝集素(Galectin)家族在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)中也起重要作用，特別是在哮喘的發(fā)病中也起著不可或缺的作用，Galectin-9在哮喘患者的血漿及肺泡灌洗液中表達(dá)顯著增加[7]，但是與哮喘相關(guān)因子關(guān)系的方面還無(wú)相應(yīng)的研究。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是一種與IL-7類(lèi)似的細(xì)胞因子，其作為氣道炎癥的上游調(diào)控因子，在哮喘發(fā)病中起著中心調(diào)控作用[8]。miRNA指長(zhǎng)度約為22nt的特殊小型非編碼RNA，可抑制促進(jìn)靶mRNA降解和/或mRNA翻譯過(guò)程，從而發(fā)揮對(duì)靶基因的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[3]。miR-31在哮喘中呈現(xiàn)異常表達(dá)情況，也可參與哮喘的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程。本文具體探討與分析了血清中STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31表達(dá)及炎癥因子的變化在哮喘兒童中的診斷價(jià)值，以闡明哮喘的發(fā)生機(jī)制，為早期診斷哮喘與預(yù)測(cè)預(yù)后提供參考，現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

資料與方法

一、研究對(duì)象

本研究得到了醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，采用總結(jié)性研究方法，研究時(shí)間為2016年2月到2018年1月，選擇在北京市大興區(qū)人民醫(yī)院診治的哮喘患兒72例作為觀(guān)察組，納入標(biāo)準(zhǔn)：足月分娩，年齡在1～6歲的兒童；符合哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn),處于哮喘緩解期患者；患兒家屬對(duì)本次研究具有知情權(quán)，且均自愿簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：心力衰竭、呼吸衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥患兒；特應(yīng)性體質(zhì)史及家族特異性疾病史患兒；免疫功能低下、21-三體綜合征綜合征，嚴(yán)重佝僂病等患兒；低出生體重兒、慢性肺疾病、先天性氣道畸形患兒。

同期選擇健康兒童72例作為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：近2周未患呼吸道感染的的健康體檢兒童，既往無(wú)哮喘史；無(wú)個(gè)人和家族特應(yīng)性病史。

兩組患兒的資料對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。觀(guān)察組患兒平均病程3.10±1.40個(gè)月；發(fā)病程度：輕度32例，中度28例，重度12例(見(jiàn)表1)。

表1 兩組患兒的一般情況對(duì)照

二、指標(biāo)檢測(cè)方法

檢測(cè)治療前1周及治療1個(gè)月時(shí)血清STAT-6、Galectin-9、TSLP指標(biāo)，抽取兩組小兒的空腹靜脈血2～3 mL，靜置1 h后4℃ 3 000 r/min離心10 min(離心半徑為15 cm)，取上層血清，保存于-80℃冰箱。

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法批量測(cè)定TNF-ɑ、IL-6等炎癥因子含量，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海生工公司。也采用ELISA法方法檢測(cè)STAT-6、Galectin-9、TSLP含量，STAT-6試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，Galectin-9試劑盒德國(guó)購(gòu)自L(fǎng)aboratorien GmbH公司，TSLP試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biocheck公司。

檢測(cè)治療前1周及治療1個(gè)月時(shí)全血miR-31指標(biāo)，取1.2中的血液樣本，EDTA抗凝后1 h內(nèi)2 000 rpm/min離心10 min，取下層全血組織，用無(wú)RNA酶的EP管進(jìn)行分裝，長(zhǎng)期凍存于-70℃超低溫冰箱。按照美國(guó)Ambion公司的RNA提取試劑盒提取血漿的總RNA，采用qRT-PCR技術(shù)(7500 Fast Real-time PCR 儀，美國(guó)ABI公司)檢測(cè)全血中miR-31表達(dá)水平，以U2為內(nèi)參。miR-31表達(dá)水平采用2-ΔΔCt計(jì)算。反應(yīng)條件為95℃ 10 min，(95℃ 15s，60℃ 1 min)×40個(gè)循環(huán)，并設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔及陰性對(duì)照。

三、臨床資料調(diào)查

采用自行設(shè)計(jì)的統(tǒng)一問(wèn)卷調(diào)查表，由專(zhuān)業(yè)人員對(duì)所有小兒家長(zhǎng)采取問(wèn)卷調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括小兒的性別、姓名、年齡、身高、潛在疾病史、既往病史、個(gè)人特應(yīng)性體質(zhì)史、特應(yīng)性家族史。還包括觀(guān)察組患兒的病程、病情等，行常規(guī)哮喘檢測(cè)治療前1周及治療1個(gè)月的肺功能指標(biāo)FEV1%和PEF%檢測(cè)。

四、統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS for Windows 20.00軟件包對(duì)本研究的所有計(jì)數(shù)、計(jì)量資料進(jìn)行數(shù)據(jù)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，組間對(duì)比采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、炎癥因子及STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31含量對(duì)比

觀(guān)察組血清TNF-ɑ、IL-6等炎癥因子含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。觀(guān)察組血清STAT-6、Galectin-9、TSLP1等含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。觀(guān)察組的全血miR-31相對(duì)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 兩組血清TNF-ɑ、IL-6等炎癥因和含量對(duì)比(pg/ml，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)

二、治療前后肺功能指標(biāo)及癥因子及STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31表達(dá)

治療后肺功能指標(biāo)FEV1%和PEF%均高于治療前，炎癥因子及STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31表達(dá)均低于治療前(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 治療前后肺功能指標(biāo)及癥因子及STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31表達(dá)

三、相關(guān)性分析

在觀(guān)察組患兒中，Pearson相關(guān)性分析顯示血清TNF-ɑ、IL-6、Galectin-9、STAT-6、TSLP 、STAT-6、TSLP、miR-31含量與肺功能指標(biāo)呈顯著負(fù)相關(guān)性，與病情等級(jí)成正相關(guān)(P<0.05)，與年齡無(wú)相關(guān)性(見(jiàn)表4)。

表4 哮喘兒童血清炎癥因子、STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31與肺功能的相關(guān)性(n=72)

四、ROC曲線(xiàn)分析

ROC曲線(xiàn)顯示炎癥因子TNF-α、IL-6的曲線(xiàn)下面積為0.922，0.947； STAT-6、Galectin-9、TSLP曲線(xiàn)下面積分別為0.918，0.927，0.936；miR-31曲線(xiàn)下面積為0.937，炎癥因子和STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31檢測(cè)兒童哮喘具很高的判斷價(jià)值。

討 論

哮喘是一種慢性反復(fù)發(fā)作性疾病，是一種以肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主，伴有巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等參與調(diào)節(jié)的氣道慢性炎癥性疾病?，F(xiàn)代研究表明氣道炎癥，氣道高反應(yīng)性及氣流受限是哮喘的三大特征，其中氣道炎癥是該病的病理基礎(chǔ)，炎癥因子的過(guò)量釋放在哮喘發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起主要作用[9]。IL-6是在機(jī)體內(nèi)的淋巴和非淋巴組織細(xì)胞中產(chǎn)生的，IL-6可參加炎癥介質(zhì)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)；TNF-ɑ被認(rèn)為是引起哮喘的最重要細(xì)胞因子之一，TNF-ɑ可促進(jìn)形成逐級(jí)放大的瀑布樣鏈鎖反應(yīng)，誘導(dǎo)組織細(xì)胞損害[10-11]。本研究顯示觀(guān)察組血清TNF-ɑ、IL-6等炎癥因子含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，表明哮喘伴隨有炎癥因子大量釋放狀態(tài)。

當(dāng)前已有證據(jù)顯示信號(hào)通路是細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)一個(gè)重要的信息傳遞工具，參與機(jī)體的生理和病理過(guò)程。STAT6是STAT家族成員之一，STAT6傳導(dǎo)通路的異常與多種過(guò)敏性疾病密切相關(guān)[12]。STAT6基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可產(chǎn)生三種結(jié)構(gòu)蛋白-STAT6a、STAT6b和STAT6c，STAT6通過(guò)JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的基因表達(dá)，促進(jìn)B細(xì)胞分化和IgE的類(lèi)型轉(zhuǎn)換，從而介導(dǎo)哮喘的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性。Galectin-9含有11個(gè)外顯子，編碼蛋白約為36 kDa，其在組織中分布十分廣泛，多分布在胰島細(xì)胞、肺臟、免疫細(xì)胞、肝臟、扁桃體中。Galectin-9能誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞聚集和活化，在細(xì)胞黏附、凋亡、分化、炎癥反應(yīng)的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。外源性IFN-Υ刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生Galectin-9[13]。TSLP是一種新型的主要由上皮細(xì)胞分泌、與IL-7類(lèi)似的Ⅰ型細(xì)胞因子，主要表達(dá)于胸腺、氣道、腸道、扁桃體、胸腺細(xì)胞中。致敏原以及病原微生物可誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)大量表達(dá)TSLP，促進(jìn)初始T細(xì)胞向效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)變，從而啟動(dòng)哮喘、支氣管炎和皮膚過(guò)敏的炎癥反應(yīng)。本研究顯示觀(guān)察組血清STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31等含量顯著高于對(duì)照組，提示上述因子在哮喘病程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)前也有研究表明TAT6敲除小鼠接缺乏典型的Th2相關(guān)趨化因子反應(yīng)，STAT6可通過(guò)上調(diào)IgE血清水平而促進(jìn)哮喘的發(fā)生[14]。Galectin-8通過(guò)與CD44的結(jié)合促進(jìn)ICAM-I的分泌，從而與哮喘炎癥及氣道重塑。TSLP可以進(jìn)一步啟動(dòng)CD4+T細(xì)胞前體分化為T(mén)h2細(xì)胞，產(chǎn)生經(jīng)典的Th2炎癥細(xì)胞因子，后者可進(jìn)一步參與免疫級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，從而參與哮喘氣道炎癥反應(yīng)和氣道黏液高分泌發(fā)生。

圖1 不同因子的ROC曲線(xiàn)

哮喘具有一定的遺傳傾向，也是一種免疫失衡性疾病，已發(fā)現(xiàn)超過(guò)100個(gè)哮喘易感基因位點(diǎn)。而通過(guò)阻斷炎癥因子細(xì)胞生成、抑制其活化，減輕Th2介導(dǎo)的氣道炎癥，有望成為哮喘治療的新策略。本研究Pearson相關(guān)性分析顯示，觀(guān)察組患兒的血清TNF-ɑ、IL-6、STAT-6、Galectin-9、TSLP及全血miR-31指標(biāo)與肺功能指標(biāo)呈顯著負(fù)相關(guān)與病情等級(jí)正相關(guān)，提示這些指標(biāo)能影響哮喘的病情。STAT6是介導(dǎo)過(guò)敏性炎性反應(yīng)的重要因子，通常由Th2相關(guān)細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α激活并誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為T(mén)h2細(xì)胞以后，與哮喘易感性之間存在關(guān)聯(lián)[15]。最新研究表明STAT6是決定Thl型細(xì)胞因子作用的關(guān)鍵信號(hào)通路，IL-6、TNF-α刺激T細(xì)胞后，出現(xiàn)STAT6的活化[16-17]。Galectin-9具有特征性的氨基酸序列，由大約130個(gè)氨基酸序列組成高度保守的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域；該因子可引起白細(xì)胞系的粘附，并對(duì)T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出重要的粘附活性；并且Galectin-9可促使整合素介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化，使ERK1/2活性增高，釋放過(guò)氧化物，促進(jìn)哮喘發(fā)作，進(jìn)一步促使氣道重塑[18]。TSLP可激活未成熟的DC細(xì)胞，促進(jìn)產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-6、TNF-α等，能夠吸引嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞聚集Th2細(xì)胞，從而啟動(dòng)過(guò)敏性炎癥[19-20]。miRNA是一類(lèi)高度保守、長(zhǎng)度很短的非編碼調(diào)控單鏈RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平，通過(guò)抑制靶基因mRNA翻譯或誘導(dǎo)靶基因mRNA降解，來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNA可參與生命過(guò)程中一系列重要的進(jìn)程，包括早期胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡、脂肪代謝等。miR-31可作為肺癌、胃癌的診斷和預(yù)后靶標(biāo)，并且其表達(dá)譜，在哮喘患者和正常人中不同，可作為診斷包括哮喘在內(nèi)的多種疾病的標(biāo)志物[21-22]。ROC分析顯示炎癥因子和STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31指標(biāo)在哮喘的診斷中具有很高的判斷價(jià)值。不過(guò)本研究也有一定的不足，研究對(duì)象的入選存在一定的偏倚，不能排除個(gè)別對(duì)象存在高反應(yīng)性，且研究的指標(biāo)也相對(duì)較少，相關(guān)性分析還需要明確，將在下一步進(jìn)行深入分析。

總之，哮喘患兒表現(xiàn)為血清STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31含量顯著升高，并伴隨有炎癥因子TNF-ɑ、IL-6的釋放，與哮喘病情存在正相關(guān)性，可影響哮喘的發(fā)生。