王劍

（寧夏食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)二站，寧夏 銀川750001）

砷是一種可致癌類金屬元素，以各種形態(tài)存在于自然界中[1]。砷在土壤中主要以三價(jià)砷As3+、五價(jià)砷As5+、一甲基砷(MMA)和二甲基砷(DMA)的形態(tài)存在，海洋產(chǎn)品中主要存在的形態(tài)砷是砷甜菜堿(AsB)和砷膽堿(AsC)[2]。無(wú)機(jī)砷通常是通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，食物在消化時(shí)含有的砷化合物破壞了人體內(nèi)酶的活性，進(jìn)而造成基因突變及變異，從而導(dǎo)致癌癥[3]。

地龍又名蚯蚓，生存于土壤中，地龍蛋白粉中含有機(jī)砷，原因是無(wú)機(jī)砷在動(dòng)物體內(nèi)的正常代謝過(guò)程中會(huì)發(fā)生甲基化，形成一甲基砷或二甲基砷[4]。作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，其藥用價(jià)值隨著新藥效的發(fā)現(xiàn)而不斷提升，促使其被砷污染情況越來(lái)越得到重視。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備見(jiàn)表1。

實(shí)驗(yàn)原料及試劑見(jiàn)表2。

實(shí)驗(yàn)所需器具及耗材：微孔濾膜（有機(jī)相），0.45μm；C18小柱；具塞離心管50mL。

1.2 試劑溶液配制

見(jiàn)表3。

1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)使用液

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)中間液

見(jiàn)表4。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)使用液

分別吸取As3+中間液、As5+中間液、MMA中間液與DMA中間液各0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00mL、2.50mL于25mL容量瓶配制出10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，用流動(dòng)相定容，搖勻。

表1 儀器設(shè)備一覽表

表2 實(shí)驗(yàn)原料及試劑

表3 試劑溶液配制

表4 標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制

2 試驗(yàn)方法

2.1 儀器參數(shù)

見(jiàn)表5。

表5 HJPLC-AFS儀器參數(shù)

2.2 樣品的制備

準(zhǔn)確稱取1.0 g（精確至0.001 g）試樣于50mL離心管中，加入20mL硝酸（0.05mol/L）溶液，靜置過(guò)夜。于60℃恒溫箱中浸提1 h，每半小時(shí)取出混勻一次。取出，冷卻至室溫，離心15min，轉(zhuǎn)速為8000r/min，取5mL上清液置于離心管中，加入5mL正己烷，振搖，靜置，棄去上層正己烷，收集提取液，經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，測(cè)定。

2.3 定性試驗(yàn)

取四種形態(tài)砷的標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋為40 ng/mL濃度的單標(biāo)溶液，依次測(cè)定，在儀器設(shè)定識(shí)別四種形態(tài)砷后，取配置好的中間濃度的混標(biāo)(40 ng/mL)溶液進(jìn)行測(cè)定。確定每種形態(tài)砷的保留時(shí)間。

圖1 四種單標(biāo)溶液譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將配制好的10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。得出結(jié)果以標(biāo)液濃度為x軸，以目標(biāo)物峰面積為y軸，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2—圖5。

圖2 三價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 二甲基砷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 一甲基砷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 五價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2、圖3、圖4、圖5可知，四種形態(tài)砷均在10～100 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)較良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.9980。

3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

3.1 提取液濃度

選取0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.15 mol/L和0.20mol/L的硝酸溶液進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6和圖6。

表6 不同提取液濃度的回收率

圖6 提取液濃度的選擇

由圖6可知，在0.05～0.15mol/L范圍內(nèi)，回收率隨著硝酸濃度的增加而增加，濃度為0.15mol/L和0.20mol/L時(shí)回收率變化平緩，故選擇濃度為0.15 mol/L的硝酸溶液為提取液。

3.2 浸提時(shí)間

選取浸提時(shí)間1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h和3.5 h進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7和圖7。

表7 不同浸提時(shí)間的回收率

圖7 恒溫浸提時(shí)間的選擇

由圖7可知，在1～2.5 h范圍內(nèi)回收率隨著浸提時(shí)間的增加而上升，浸提時(shí)間為2.5～3.5 h回收率變化平緩，故選擇2.5 h作為浸提時(shí)間。

3.3 浸提溫度

選取恒溫浸提溫度60℃、70℃、80℃、90℃和100℃進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8和圖8。

表8 不同浸提溫度的回收率

圖8 恒溫浸提溫度的選擇

由圖8可知，浸提溫度在60℃、70℃時(shí)回收率過(guò)低，80℃回收率有部分未達(dá)標(biāo)，100℃時(shí)提取狀況很不穩(wěn)定，形態(tài)砷會(huì)發(fā)生相互轉(zhuǎn)換，故選擇90℃為浸提溫度。

3.4 正己烷去脂次數(shù)

選取正己烷1次、2次、3次去脂進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9和圖9。

由圖9可知，去脂一次的回收率較低，說(shuō)明油脂包裹待測(cè)物影響了檢測(cè)結(jié)果，去脂兩次與三次的回收率非常接近，在提取過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，去脂兩次后的正己烷有渾濁現(xiàn)象，去脂三次后的正己烷已近澄清，故選擇正己烷去脂次數(shù)為兩次。

表9 去脂次數(shù)與回收率的關(guān)系

圖9 正己烷去脂次數(shù)的選擇

4 結(jié)論

本論文通過(guò)對(duì)提取劑濃度、浸提時(shí)間、浸提溫度、去脂次數(shù)、等前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，建立了應(yīng)用HPLC-AFS法對(duì)地龍蛋白粉中As3+、As5+、MMA和DMA四種砷形態(tài)分析的前處理方法。該方法優(yōu)化為：提取劑選擇0.15mol/L硝酸溶液，恒溫浸提時(shí)間選擇2.5小時(shí)，浸提溫度選擇90℃，正己烷去脂兩次，三價(jià)砷回收率為98%、二甲基砷回收率為93%、一甲基砷回收率為94%、五價(jià)砷回收率為101%，可應(yīng)用推廣。