周艷紅

（陜西國際商貿(mào)學院，陜西 西安712046）

雙水相萃取是利用目標物質(zhì)在兩相間的溶解度即分配系數(shù)不同而實現(xiàn)分離的一種技術手段，其傳質(zhì)快、試驗條件及操作環(huán)境溫和，離子液體[1]是新一代綠色設計溶劑,具有優(yōu)異的溶劑化性能，離子液體雙水相[2-6]在萃取方面顯示了良好的應用前景。

柿葉中含有豐富的維生素、蘆丁以及鐵、鋅、鈣等對人體健康有益的多功能營養(yǎng)成分，現(xiàn)代藥理學研究表明柿葉具有清熱解毒、潤肺強心、鎮(zhèn)咳止血、改善血管通透性等多種醫(yī)療保健功能，黃酮作為柿葉的有效成分之一，具有降血糖、抗菌、抗腫瘤、止血、調(diào)血脂、改善微循環(huán)等藥理作用，藥用價值高，開發(fā)前景樂觀。

目前，國內(nèi)對柿葉中總黃酮[7,8]的研究報道頗多，但都集中于傳統(tǒng)的有機溶劑萃取方面。本實驗用離子液體雙水相作為提取劑對柿葉有效部位總黃酮進行了提取，效果較好，為柿葉的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

柿子葉，采摘于陜西省西安市西咸新區(qū)樹葉林。

蘆丁標準品（含量>98%，批號：100080-201202），中國食品藥品檢定研究院；離子液體，阿拉丁試劑（上海有限公司）；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

UV-2102PC型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司），KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），D5-R2型離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司），電子天平（北京賽多利斯天平有限公司），多功能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 標準曲線的繪制

以蘆丁為標準物，測定510 nm處的吸光度,蘆丁溶液濃度（c）為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程：Y蘆丁=1.3643X+0.0047(R2=0.9999)。

1.3 柿子葉的預處理

將柿子葉于60℃烘干至恒重，粉碎，過篩，取干燥后的柿子葉粉若干，加入石油醚，用索氏提取器進行脫色處理，然后將得到的柿子葉粉置于陽光下，除去其中的石油醚，裝入密封袋中，備用。

1.4 柿葉中總黃酮含量的測定

向25mL具塞磨口錐形瓶中加入一定質(zhì)量的[C4mim]Br離子液體和(NH4)2SO4，用蒸餾水補充，使整個離子液體/鹽體系質(zhì)量維持在5 g，混合物充分攪拌至鹽完全溶解后加入一定質(zhì)量的樣品粉末m（g），調(diào)節(jié)pH，在適當?shù)臏囟葪l件下萃取一定時間，參比溶液加入相同（樣品粉末除外）的成分。溶液形成兩相，上相富含離子液體及黃酮，雜質(zhì)留在鹽相中，記錄上層液體的體積（Vt）、下層液體的體積（Vb）。按標準曲線測定方法測上層溶液和下層溶液的吸光度A，根據(jù)標準曲線方程計算出上相黃酮濃度（Ct）和下相黃酮濃度（Cb）。

相比：R=Vt/Vb

分配系數(shù)：kd=ct/cb

提取率（mg·g-1）=Vt·ct/m

1.5 提取工藝優(yōu)化

在超聲功率為100W的條件下，進行單因素實驗，分別考察料液比、提取時間、提取溫度和離子液體濃度對總黃酮提取率的影響，依據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設計原理，在單因素的基礎上選擇提取時間（A）、離子液體濃度（B）、提取溫度（C）為考察因素，利用響應面法優(yōu)化柿子葉中總黃酮的工藝參數(shù)。

1.6 雙水相體系的確定

同等條件下選取不同碳鏈長度的離子液體[C2mim]Br、[C4mim]Br、[C6mim]Br、[C8mim]Br/(NH4)2SO4雙水相體系提取柿葉中的總黃酮，陽離子碳鏈長度對黃酮類化合物提取量的影響如圖1所示。由圖1可以看出，烷基鏈由乙基增大到丁基，提取量逐漸增大。當碳鏈長度繼續(xù)增長，提取量不增反降，因此選取[C4mim]Br/(NH4)2SO4為本實驗的雙水相體系。

圖1 不同離子液體柿葉中總黃酮的提取率

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素考察柿葉中總黃酮的提取工藝

2.1.1 離子液體濃度對黃酮提取率的影響

在[C4mim]Br/(NH4)2SO4雙水相體系中，提取時間為40min，提取溫度為50℃，料液比為1∶20，分別加入濃度為0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1.0mol/L的離子液體[C4mim]Br。由圖2可知，當[C4mim]Br濃度小于0.7mol/L時，柿子葉總黃酮提取率和分配系數(shù)隨[C4mim]Br濃度的增加而增大，這主要是因為[C4mim]Br與黃酮類化合物之間形成π-π相互作用，并且水與離子液體、總黃酮可形成氫鍵網(wǎng)絡，在親水極性區(qū)形成的網(wǎng)絡結(jié)構可以增加總黃酮的親水性，使其在極性區(qū)穩(wěn)定地存在，促進了總黃酮在兩相間的轉(zhuǎn)移；當濃度等于0.7mol/L時，柿子葉總黃酮和分配系數(shù)達到最大，說明有更多的黃酮富集在離子液體中；離子液體大于0.7mol/L時，柿子葉總黃酮和分配系數(shù)隨濃度增加而減小，因為當離子液體濃度過大時，體積排阻效應增大導致總黃酮在相間的傳遞以及在相中的擴散阻力大大增加，阻礙了總黃酮進入離子液體相，分配系數(shù)、提取率逐漸降低。所以離子液體[C4mim]Br最佳濃度為0.7mol/L。

圖2 離子液體濃度對分配系數(shù)和黃酮提取率的影響

2.1.2 提取溫度對總黃酮提取率的影響

在[C4mim]Br/(NH4)2SO4雙水相體系中，提取時間為40min，料液比為1∶20，離子液體濃度為0.7mol/L，選 取 提 取 溫 度 為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。由圖3可知，當體系溫度低于60℃時，柿葉總黃酮的分配系數(shù)和提取率隨溫度升高而逐漸增大，其原因是溫度升高，上相離子液體中富集的黃酮含量增多；溫度大于60℃時，柿葉總黃酮的分配系數(shù)和提取率隨溫度的升高逐漸減小，主要是因為溫度過高會導致黃酮分解，同時溫度過高會使硫酸銨分解，鹽析能力降低，離子液體與黃酮的相互作用力減小，使上相離子液體相中黃酮含量不再增多甚至因分解而減小，導致分配系數(shù)和提取率減小。所以綜合考慮，選擇最佳的提取溫度為60℃。

圖3 提取溫度對分配系數(shù)和黃酮提取率的影響

2.1.3 提取時間對總黃酮提取率的影響

在[C4mim]Br/(NH4)2SO4雙水相體系中，提取溫度為60℃，料液比為1∶20，離子液體濃度為0.7mol/L，選取提取時間為30min、40min、50min、60min、70min、80min。實驗結(jié)果如圖4所示：分配系數(shù)和提取率隨著提取時間的增加而逐漸增大，主要是因為上相離子液體富集的黃酮含量隨著時間的增加而增大。當提取時間大于50min時，分配系數(shù)和總黃酮提取率減小，推測主要是因為黃酮在長時間機械效應和熱效應下不穩(wěn)定，發(fā)生分解或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，導致提取量降低。確定50min為最適宜超聲時間。

圖4 提取時間對分配系數(shù)和黃酮提取率的影響

2.1.4 料液比對總黃酮提取率的影響

在[C4mim]Br/(NH4)2SO4雙水相體系中，提取溫度為60℃，提取時間為50min，離子液體濃度為0.7mol/L，選取料液比為：1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35。實驗結(jié)果如圖5所示，分配系數(shù)和提取率隨料液比增加而增大，在1∶25時最大.隨后逐漸減小，主要是因為料液比大于1∶25時，柿子葉粉質(zhì)量較大，不利于柿子葉粉的溶解和擴散，溶劑中黃酮類物質(zhì)的溶出受到影響，而料液比小于1∶25時，總黃酮已基本完全溶出，因此提取量不再增加，且會增加濃縮成本，導致提取量降低，確定料液比最佳條件為1∶25。

圖5 料液比對分配系數(shù)和黃酮提取率的影響

2.2 響應面法實驗結(jié)果

2.2.1 響應面試驗結(jié)果及方差分析

在單因素試驗的基礎上，選取離子液體濃度（A）、提取時間（B）和提取溫度（C）等3因素按照Box-Behnken中心組合設計方案進行優(yōu)化試驗[9,10]，結(jié)果如表1及表2所示。

表1 星點設計因素與水平

表2 響應面試驗以及響應值

對表2中數(shù)據(jù)進行回歸擬合，獲得擬合方程為Y=26.63-0.00875A+0.00375B+0.43C+0.23AB-0.34AC+0.29BC-0.72A2-0.68B2-0.58C2對回歸方程進行方差分析。由表3可以看出，試驗回歸模型P＜0.01，說明回歸模型達到高度顯著水平；失擬項P=0.2803＞0.05，失擬項不顯著，說明試驗數(shù)據(jù)與模型擬合良好。該模型擬合的最佳提取工藝為離子液體濃度為0.7mol/L，超聲時間為50.00 min，超聲溫度為60℃，在該條件下預測總黃酮提取量可以達到26.62 mg/g，A2，B2，C2的P值均小于0.05，說明提取時間、提取濃度、提取溫度對柿子葉中總黃酮的提取量有很大的影響。

表3 響應面方差分析表

2.2.2 響應面分析

根據(jù)Box-Behnken軟件分析實驗數(shù)據(jù)并獲得響應模型，保持三個變量因素中的一個不改變，得到離子液體濃度、提取時間、體系溫度之間其他兩個因素之間的三維響應面曲線和輪廓曲線，所得結(jié)果見圖6（a）、6（b）和6（c）。根據(jù)Box-Behnken軟件模型所得的結(jié)果和統(tǒng)計學進行方差分析（ANOVA）獲得離子液體雙水相各個因素的最佳組合條件為濃度為0.7mol/L，超聲時間為50min，超聲溫度為60℃，黃酮提取量可以達到26.62mg/g。

圖6 響應模型

2.2.3 驗證實驗

為驗證該擬合模型的可靠性，同時為了試驗操作實施的便利，在離子液體濃度為0.7mol/L、超聲時間50min、超聲溫度60℃條件下，固定其他各因素不變，進行3次平行試驗。結(jié)果在該工藝條件下，柿子葉總黃酮提取量為26.84mg/g，與預測值之間相差較小，說明該模型能夠很好地擬合柿子葉總黃酮的提取過程，優(yōu)化得到的最佳提取條件參數(shù)可靠性較好。

2.2.4 對比實驗

分別以同濃度乙醇、離子液體、離子液體/(NH4)2SO4體系提取柿葉中的黃酮，時間為50min，溫度為40℃，料液比為1∶10，從表4可以看出雙水相體系的提取率最高。

表4 三種提取劑的對比研究

2.2.5 柿葉總黃酮抗自由基實驗結(jié)果

對柿葉中總黃酮及Vc對DPPH自由基、羥自由基以及超氧自由基的清除能力進行了研究[11]，結(jié)果如表5。結(jié)果表明柿葉總黃酮具有較高的清除DPPH自由基和羥自由基的能力，對DPPH自由基的清除率達到86%，略高于同濃度的Vc。對羥自由基的清除率達到68%，高于同濃度的Vc，而對超氧自由基清除能力低于Vc，清除率只有30%，比同濃度的Vc低了10%。

表5 對自由基的清除實驗結(jié)果

3 結(jié)論

本文采用超聲輔助[C4mim]Br/(NH4)2SO4雙水相提取柿葉中的總黃酮，確定離子液體的種類，離子液體的濃度，超聲提取時間、溫度和液固比值為影響提取率的因素，并優(yōu)化了提取條件。離子液體提取黃酮類化合物的最佳條件為：離子液體種類為[C4mim]Br，離子液體濃度為0.7mol/L，提取時間為50分鐘，提取溫度為60℃，液固比為1∶25。此時提取黃酮類化合物的效率最高。與無水乙醇作為提取劑提取柿葉中的黃酮的方法相比，具有特殊結(jié)構性質(zhì)的離子液體能夠更好地溶解出柿葉中的黃酮類物質(zhì)，優(yōu)化的工藝為工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)提供了參考數(shù)據(jù)。