陳明明，李克寒，劉相樂，姚晶，馬慧穎

(1.河南科技大學第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南 洛陽 471000； 2.洛陽市第三人民醫(yī)院麻醉科，河南 洛陽 471000)

鼻咽癌是最常見的頭頸部腫瘤之一，是一種發(fā)生于鼻咽腔頂部和側壁的惡性腫瘤。由于其區(qū)域分布和家族聚集，主要在中國南部和東南亞國家流行[1]。由于鼻咽區(qū)域中復雜的解剖結構，在這種類型的癌癥中很少進行手術，并且化學療法受到各種嚴重副作用的限制[2]。近年來癌癥治療手段取得不少進步，但鼻咽癌患者的5年生存率仍然徘徊在50%～70%[3]。因此，迫切需要開發(fā)能夠治療鼻咽癌的新藥物。先前的研究表明，一些麻醉劑不僅通過阻斷圍手術期應激反應，而且還通過誘導抗癌效應來抑制癌癥轉移[4]。依托咪酯是一種催眠性靜脈全麻藥，是咪唑類衍生物，由于其安全性高，是麻醉誘導常用的藥物之一。已有研究表明，依托咪酯抑制A549肺腺癌細胞的侵襲和遷移[5]，但依托咪酯對鼻咽癌的作用尚不清楚。Hippo信號通路是一個調節(jié)器官大小、組織再生和癌癥的關鍵信號通路，已有研究證明Hippo通路參與鼻咽癌細胞上皮間質轉化[6]。本文主要研究依托咪酯通過調節(jié)Hippo信號通路對鼻咽癌細胞CNE-1和HNE-1的侵襲遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

順鉑(浙江聯(lián)碩生物科技有限公司，批號：PHR1624)，依托咪酯(HPLC≥99%，上海麥克林生物技術股份有限公司，批號：33125-97-2)，RPMI-1640培養(yǎng)液(上海栩冉生物科技有限公司，批號：C22400500BT)，胎牛血清(素爾生物科技有限公司，批號：16000-044)，MTT試劑盒(上海澤葉生物科技有限公司，批號：ZY111105)，RIPA裂解緩沖液(南京?？藸柹锟萍加邢薰?，批號：SBJ-0999)，BCA試劑盒(上海易色醫(yī)療科技有限公司，批號：BC201)，辣根過氧化物酶標記的二抗、SGK3抗體、MST抗體、p-MST抗體、LAST抗體、p-LAST抗體、YAP抗體、p-YAP抗體(上海艾博抗生物科技有限公司，批號： ab6728、ab126108、ab85377、ab79199、ab70561、ab111344、ab205270、ab76252),Transwell小室(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司，批號：3422)，XMU-MP-1(Selleckchem，批號#S8334,)。

1.2 細胞培養(yǎng)

鼻咽癌細胞CNE-1和HNE-1購自上海復祥生物科技有限公司。鼻咽癌細胞CNE-1和HNE-1細胞在37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2條件下，于含有體積分數(shù)為10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測細胞活性

在96孔板中，將鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞分別用不同濃度(0、5、10、20、40、80、160 μmol/L)處理12 h、24 h、48 h時，再用10 μL MTT染料處理細胞，然后與100 μL二甲基亞砜孵育15 min，用酶免疫分析儀在490 nm處測量吸光度。用各濃度處理組細胞吸光值與0 μmol/L組細胞的吸光度表示細胞活性。

1.4 分組及處理

將鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞分別分為對照組、依托咪酯低劑量組、依托咪酯中劑量組、依托咪酯高劑量組、順鉑組、Hippo通路抑制劑(XMU-MP-1)組、依托咪酯高劑量+XMU-MP-1組。對照組、依托咪酯低、中、高劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞用終濃度含有依托咪酯 0、10、20、40 μg/mL培養(yǎng)基培養(yǎng)；順鉑組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞用終濃度含有Cisplatin 10 μg/mL培養(yǎng)基培養(yǎng)；Hippo通路抑制劑組和依托咪酯高劑量+XMU-MP-1組鼻咽癌細胞CNE-1和HNE-1用終濃度含有XMU-MP-1 10 μg/mL和依托咪酯 0、40 μg/mL培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

將各組轉染的鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞以1×106細胞/孔的密度接種在12孔板中，鋪滿單層后，用小號槍頭垂直在孔中間劃痕。在CO2體積分數(shù)為5%、37 ℃恒溫的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后。在劃痕0 h和24 h拍攝的圖像，使用ImageJ評估細胞遷移能力。細胞遷移率(%)=(0 h時的劃痕面積-24 h時的劃痕面積)/0 h的劃痕面積×100%。

1.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲

在 Transwell 小室中鋪 40 μL matrigel 基質膠，在細胞培養(yǎng)箱中使其凝固，然后在Transwell小室上室接種鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞懸浮液和不含血清的培養(yǎng)基，終濃度為 2.5×105個/mL，并在Transwell小室下室加入含血清和絲裂霉素C的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，取出Transwell 小室，用結晶紫染色，并在顯微鏡下觀察分析。

1.7 蛋白質印跡分析檢測p-MST、p-LATS、p-YAP、MST、LATS、YAP蛋白表達水平

在裂解緩沖液中提取總蛋白質，并用BCA測定試劑盒測量蛋白質濃度。將10 μg 蛋白樣品用10% SDS-PAGE分離后轉移至PVDF膜上。 用5%脫脂奶粉封閉膜，然后用一抗(p-MST 1∶500、p-LATS 1∶500、p-YAP 1∶10 000、MST1∶100、LATS 1∶5000、YAP 1∶1000)在4 ℃封閉過夜，接著加入對應辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫孵育1 h，最后滴ECL曝光)，然后再次用TBST洗滌3次。 使用ECL系統(tǒng)檢測結合的抗體。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 依托咪酯對鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞存活率的影響

隨著依托咪酯濃度的增加，鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞活性明顯下降；隨著培養(yǎng)時間增加，鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞活性逐漸下降。當依托咪酯濃度為 5、10、20、40 μg/mL時，鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞活性>80%，毒性較低。因此，本研究選擇依托咪酯10、20、40 μg/mL作后續(xù)研究。當濃度相同時，24 h和48 h與12 h比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而24 h 和48 h之間比較無明顯差異，因此，選擇藥物作用時間24 h作后續(xù)實驗。見圖1。

2.2 依托咪酯對鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞遷移的影響

與對照組相比，依托咪酯低劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞遷移率無明顯差異，依托咪酯中劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞遷移率有所減少(P<0.05)，依托咪酯高劑量組和順鉑組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞遷移率明顯減少(P<0.01)。見圖2。

2.3 依托咪酯對鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞侵襲的影響

與對照組相比，依托咪酯低劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞侵襲細胞數(shù)目無明顯差異，依托咪酯中劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞侵襲細胞數(shù)目有所減少(P<0.05)，依托咪酯高劑量組和順鉑組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞侵襲細胞數(shù)目明顯減少(P<0.01)。見圖3。

2.4 依托咪酯對鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞Hippo信號通路的影響

與對照組相比，依托咪酯低劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達無明顯差異，依托咪酯中劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達有所上調(P<0.05)，依托咪酯高劑量組和順鉑組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達明顯上調(P<0.01)。見圖4。

A. MTT法檢測鼻咽癌CNE-1細胞活性； B. MTT法檢測鼻咽癌HNE-1細胞活性。

A.劃痕實驗檢測鼻咽癌CNE-1細胞遷移; B.劃痕實驗檢測鼻咽癌HNE-1細胞遷移; 與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

A. Transwell實驗檢測鼻咽癌CNE-1細胞侵襲; B. Transwell實驗檢測鼻咽癌HNE-1細胞侵襲; 與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

2.5 XMU-MP-1對依托咪酯激活Hippo信號通路的影響

與對照組相比，XMU-MP-1組p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達明顯下調(P<0.05)；與依托咪酯高劑量組相比，依托咪酯高劑量+XMU-MP-1組p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達明顯下調(P<0.01)；見圖5。

2.6 XMU-MP-1對依托咪酯抑制鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞遷移的影響

與對照組相比，在XMU-MP-1組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞遷移率明顯增加(P<0.05)；與依托咪酯高劑量組相比，在依托咪酯高劑量+XMU-MP-1組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞遷移率明顯增加(P<0.01)。見圖6。

2.7 XMU-MP-1對依托咪酯抑制鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞侵襲的影響

與對照組相比，在XMU-MP-1組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞侵襲細胞數(shù)目明顯增加(P<0.05)；與依托咪酯高劑量組相比，在依托咪酯高劑量+XMU-MP-1組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞侵襲細胞數(shù)目明顯增加(P<0.01)。見圖7。

3 討論

鼻咽癌是最具侵襲性的頭頸部鱗狀細胞癌之一，經常轉移到遠處的淋巴結和器官。由于鼻咽癌致死率高，治療后生活質量低，且鼻咽癌復發(fā)率高，所以該病的治療仍是一個具有挑戰(zhàn)性的臨床問題[7]。順鉑是一種鉑類抗腫瘤化療藥物，用于治療包括鼻咽癌在內的多種實體惡性腫瘤。雖然具有較高的初始響應性，但多數(shù)鼻咽癌患者不久就會出現(xiàn)獲得性耐藥，最終導致復發(fā)或轉移。麻醉劑可通過誘導抗癌效應來抑制癌癥轉移[8]。依托咪酯減少心血管副作用并能夠維持麻醉期間的血流動力學的穩(wěn)定性，是臨床上理想的鎮(zhèn)靜和麻醉藥。

A.蛋白印跡法檢測鼻咽癌CNE-1細胞Hippo信號通路相關蛋白表達水平; B.蛋白印跡法檢測鼻咽癌HNE-1細胞Hippo信號通路相關蛋白表達水平; 與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

A.蛋白印跡法檢測鼻咽癌CNE-1細胞Hippo信號通路相關蛋白表達水平; B.蛋白印跡法檢測鼻咽癌HNE-1細胞Hippo信號通路相關蛋白表達水平; 與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01; 與依托咪酯高劑量組比較：##P<0.01。

A.劃痕實驗檢測鼻咽癌CNE-1細胞遷移; B.劃痕實驗檢測鼻咽癌HNE-1細胞遷移; 與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01; 與依托咪酯高劑量組比較：##P<0.01。

A. Transwell實驗檢測鼻咽癌CNE-1細胞侵襲; B. Transwell實驗檢測鼻咽癌HNE-1細胞侵襲; 與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01; 與依托咪酯高劑量組比較：##P<0.01。

臨床發(fā)現(xiàn)長期應用依托咪酯會引起免疫抑制作用以及增加細胞毒效應的作用[9]。已有研究表明，依托咪酯可具有直接誘導人肝癌HepG2細胞體外凋亡的作用[10]，依托咪酯抑制A549肺腺癌細胞的侵襲和遷移[5]。因此，依托咪酯具有抗癌作用。鼻咽癌高復發(fā)和高轉移與腫瘤細胞的侵襲和遷移能力密切相關，有效抑制人鼻咽癌細胞的侵襲和遷移可以抑制鼻咽癌的發(fā)展，如，蛇床子素可抑制CNE2細胞的增殖、侵襲和遷移，其機制可能與調節(jié)Wnt/β-catenin信號通路進而抑制EMT過程有關[11]；甲基蓮心堿通過抑制miR-423-5p的表達作用于下游靶基因SMIM3、NGF，抑制上皮間質轉化相關蛋白的表達，從而抑制鼻咽癌細胞的侵襲轉移[12]。本文研究發(fā)現(xiàn)，依托咪酯抑制鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞的遷移侵襲，其與Hippo通路激活有關。

Hippo通路響應多種細胞外和細胞內信號，從細胞間的接觸和機械信號到G蛋白偶聯(lián)受體的配體和代謝通路。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Hippo信號通路能夠協(xié)調細胞增殖、細胞死亡和細胞分化，調控組織生長的一個高度保守的生長控制信號通路[13]。Hippo通路的核心包含一個核心激酶盒，該核心盒由一對相關的絲氨酸/蘇氨酸激酶、MST1和MST2組成[14]。Hippo信號通路上游膜蛋白受體作為胞外生長抑制信號的感受器，一旦感受到胞外生長抑制信號，就會激活一系列激酶級聯(lián)磷酸化反應，最終磷酸化下游效應因子YAP和TAZ[15]。而細胞骨架蛋白會與磷酸化后的YAP和TAZ結合，使它滯留在細胞質內，并刺激它們的泛素介導的蛋白水解作用，降低其細胞核活性，從而實現(xiàn)對細胞生長的調控[16]。 本文研究發(fā)現(xiàn)，依托咪酯上調鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞中p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達。當Hippo通路被激活時，其功能相當于腫瘤抑制因子。然而，這一途徑的失調有助于增加細胞增殖，減少細胞凋亡和分化。因此，通過藥理學調節(jié)劑調控Hippo信號可能是一種有前途的抗癌策略[17]。Hippo通路具有獨特的致瘤能力，其核心成分(MST1/2、LATS1/2、YAP和TAZ)的突變和表達改變促進了癌細胞的遷移、侵襲和惡性[18]。如，非受體酪氨酸磷酸酶14通過調節(jié)Hippo信號通路YAP的磷酸化來促進胃癌細胞的增殖和遷移[19]。已有研究發(fā)現(xiàn)，Hippo通路參與鼻咽癌細胞上皮間質轉化[6]，低濃度佛手柑內酯能顯著抑制鼻咽癌的腫瘤干細胞特性，其可能原因與激活腫瘤細胞中Hippo信號通路相關[20]。本文研究發(fā)現(xiàn)，添加Hippo通路抑制劑XMU-MP-1可下調p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達，促進鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞的遷移侵襲，同時逆轉依托咪酯對鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞的遷移侵襲的抑制作用。

綜上所述，本文研究發(fā)現(xiàn)依托咪酯通過調節(jié)Hippo信號通路抑制鼻咽癌細胞CNE-1和HNE-1的侵襲遷移，因此，依托咪酯有望成為鼻咽癌治療的新藥物。本研究僅為體外細胞實驗和機制的初步探討，體內實驗有待進一步研究。