魯翔華，陳皇，馬雙雙，李利亞(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 a.中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科,b.病理科，北京 100029)

小細(xì)胞肺癌(small lung cell cancer, SCLC)病情進(jìn)展快、惡性程度高，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，致使多數(shù)SCLC患者確診時(shí)已是晚期，生存預(yù)后差。而早期診斷、及時(shí)評(píng)估患者病情進(jìn)展是延長SCLC患者生存時(shí)間的有效方法。研究顯示，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell, CTC)在SCLC人群中的檢出率為67%～86%，且CTC半衰期為1.0～2.4 h，使得CTC可動(dòng)態(tài)監(jiān)控癌癥轉(zhuǎn)移，成為可實(shí)時(shí)反映轉(zhuǎn)移情況的標(biāo)志物[1]。本研究采用葉酸受體靶向PCR技術(shù)(ligand-targeted polymerase chain reaction, LT-PCR)定量檢測(cè)SCLC患者血液樣本中的CTC含量，并在SCLC患者接受2個(gè)周期化療后對(duì)其進(jìn)行實(shí)體瘤RECIST評(píng)分，以探討CTC對(duì)于SCLC患者化療效果的預(yù)測(cè)價(jià)值及與SCLC相關(guān)腫瘤標(biāo)志物——胃泌素釋放肽前體(pro-gastrin-releasing peptide, pro-GRP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)、癌胚抗原 (carcino-embryonic antigen, CEA)等[2-3]的預(yù)測(cè)效能對(duì)比。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 收集2018年10月至2019年10月于中日友好醫(yī)院就診的SCLC患者42例，男34例，女8例，年齡48～82歲，中位年齡63歲；既往有吸煙史患者29例，無吸煙史患者13例。納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)均經(jīng)過病理組織學(xué)明確診斷；(2)采血前未接受過化療、放療或其他抗癌治療；(3)無合并嚴(yán)重的心肝腎疾病、精神疾病或其他惡性腫瘤；(4)病歷資料記錄完整。SCLC患者分期檢查包括胸部計(jì)算機(jī)斷層掃描、顱腦核磁共振、骨掃描和頸腹部彩色超聲等；按照美國退伍軍人肺癌協(xié)會(huì)(Veterans Administration Lung Study Group, VALG)的局限期(limited disease, LD)和廣泛期(extensive disease, ED)進(jìn)行分期[4]，其中LD 15例，ED 27例。根據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)發(fā)布的SCLC診療指南[4]推薦的SCLC患者一線化療用藥方案進(jìn)行化療，在化療前及化療2個(gè)周期后進(jìn)行影像學(xué)檢查，使用實(shí)體瘤RECIST評(píng)級(jí)進(jìn)行療效評(píng)估，其中部分緩解(partial remission, PR)14例，疾病穩(wěn)定(stable condition, SD)19例，疾病進(jìn)展(disease progression, PD)7例，完全緩解(complete remission, CR)1例，死亡1例。

1.2主要試劑與儀器 微型臺(tái)式真空泵(海門其林貝爾公司)，垂直混勻儀(寧波新芝生物公司)，低溫高速離心機(jī)(德國Sigma公司)，ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Lifetechnologies公司)。FR+-CTC試劑盒(上海格諾思博公司)，Advia Centaur型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套pro-GRP、NSE、CEA檢測(cè)試劑盒(德國拜爾公司)。

1.3標(biāo)本采集 采集患者入院治療前的空腹靜脈血3～5 mL，EDTA-K2抗凝，置于4 ℃保存，并于24 h內(nèi)完成檢測(cè)。

1.4LT-PCR定量檢測(cè)CTC 取3 mL全血樣本，加入紅細(xì)胞裂解液，4 ℃裂解15 min，去除紅細(xì)胞后加入150 μL抗CD45磁珠和50 μL抗CD14磁珠，4 ℃反應(yīng)30 min，分別去除白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。將樣品中剩余的細(xì)胞(包括CTC)進(jìn)行檢測(cè)，使用特異性小分子探針對(duì)CTC表面高表達(dá)的葉酸受體(folatereceptor，F(xiàn)R)進(jìn)行標(biāo)記和鑒別，最后使用特異性吸引物結(jié)合Taqman探針(5′-FAM-CAGTTGAGGGTTC-MGB-3′)，用PCR對(duì)CTC結(jié)合的小分子探針進(jìn)行定量檢測(cè)。加入10 μL含有腫瘤特異性葉酸配體-寡核苷酸偶合物的探針標(biāo)記液，室溫溫育40 min，加入1 mL洗滌緩沖液，4 ℃、500×g離心10 min，重復(fù)3次，去除未結(jié)合的探針。最后加入120 μL洗脫緩沖液，4 ℃溫育2 min，洗脫下已結(jié)合的探針，瞬時(shí)離心，收集沉淀，加入24 μL中和緩沖液，用于熒光定量PCR擴(kuò)增分析。PCR信號(hào)與數(shù)據(jù)分析采用ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行，反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，40 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，8 ℃ 5 min，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，35 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s。CTC判定標(biāo)準(zhǔn)：熒光染色為CK+/CD45-,DAPI+，有完整的胞膜胞核形態(tài)。計(jì)數(shù)3 mL血液中檢測(cè)到的FR+-CTC，評(píng)估樣本中的CTC含量，按試劑盒說明書以CTC≥8.7 FU/3 mL為陽性標(biāo)準(zhǔn)。

1.5pro-GRP、NSE、CEA檢測(cè) 取各研究對(duì)象入院時(shí)的空腹靜脈血5 mL，按Advia Centaur型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套pro-GRP、NSE、CEA檢測(cè)試劑盒說明書,進(jìn)行檢測(cè)及結(jié)果判讀。陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：pro-GRP>50 pg/mL,NSE>17.00 ng/mL,CEA>5.00 ng/mL。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。CTC含量經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，呈偏態(tài)分布，數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25,P75)]表示，各組數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)方差不齊，采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)比較總體差異，Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，雙變量相關(guān)分析用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SCLC患者的CTC計(jì)數(shù)水平 CTC在SCLC患者血液標(biāo)本中的表達(dá)水平為12.05(7.55,15.81)FU/3 mL，CTC的陽性率為71.43%(30/42)。SCLC患者的性別、年齡、吸煙史等臨床參數(shù)與CTC的表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。而不同分期SCLC患者的CTC表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=96.50，P=0.005)。見表1。

表1 SCLC患者的CTC含量[M(P25,P75)]

2.2CTC與pro-GRP、NSE、CEA相關(guān)性分析 SCLC患者pro-GRP含量為156.06(38.21,900.36) pg/mL，NSE含量為18.50(11.00,32.25) ng/mL，CEA含量為2.99(2.17,5.69) ng/mL，經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，CTC與pro-GRP、NSE、CEA均無相關(guān)性(r分別為0.123、0.176、0.026，P均>0.05)。

2.3CTC與pro-GRP、NSE、CEA對(duì)SCLC化療療效的預(yù)測(cè)效能比較 不同化療療效評(píng)級(jí)的SCLC患者的CTC表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，化療療效評(píng)級(jí)越差的患者CTC的表達(dá)水平越高；PR組與SD組間CTC表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但化療獲益組(PR組、SD組)與PD組患者CTC表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CR患者中1例CTC表達(dá)陰性，死亡患者中1例CTC表達(dá)陽性。見表2。

表2 CTC與SCLC患者化療療效評(píng)級(jí)的相關(guān)性分析

不同化療療效評(píng)級(jí)的SCLC患者pro-GRP、NSE、CEA的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，化療獲益組(PR組、SD組)與PD組患者pro-GRP、NSE、CEA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；1例CR患者各項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)均為陰性；1例死亡患者各項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)均為陽性。見表3。

表3 pro-GRP、NSE、CEA與SCLC患者化療療效評(píng)級(jí)相關(guān)性分析

3 討論

本研究使用的LT-PCR技術(shù)特異性高，操作簡(jiǎn)便，故而采用該技術(shù)檢測(cè)CTC,并評(píng)價(jià)CTC對(duì)SCLC患者化療療效的預(yù)測(cè)效能及與pro-GRP、NSE、CEA等腫瘤標(biāo)志物的預(yù)測(cè)效能進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示SCLC分期越差患者的CTC表達(dá)水平越高，提示CTC可用于輔助判斷SCLC患者疾病分期。此外，CTC可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)SCLC患者疾病進(jìn)展情況，彌補(bǔ)影像學(xué)檢查的空窗期。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，CTC與pro-GRP、NSE、CEA均無相關(guān)性，表明CTC有望成為一種新的標(biāo)志物。在化療療效預(yù)測(cè)效能上，化療前CTC表達(dá)水平越高的患者在化療后RECIST評(píng)級(jí)越差，PD組患者化療前的CTC表達(dá)水平顯著高于化療獲益組患者，不同化療評(píng)級(jí)的SCLC患者化療前pro-GRP、NSE、CEA的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，CTC預(yù)測(cè)化療療效的效能優(yōu)于其他腫瘤標(biāo)志物。

Shen等[5]的研究納入了80例SCLC患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTC是對(duì)接受化療的SCLC患者的療效有評(píng)估價(jià)值的標(biāo)志物。本研究結(jié)果提示，CTC對(duì)于SCLC患者的化療療效評(píng)估具有一定的臨床意義，其預(yù)測(cè)效能優(yōu)于其他腫瘤標(biāo)志物，進(jìn)一步佐證了該研究結(jié)果的正確性。Syrigos等[6]在關(guān)于非小細(xì)胞肺癌的研究中證實(shí)，CTC表達(dá)水平較高的患者較低水平患者的療效及生存預(yù)后更差，雖然其研究對(duì)象的病理分型與本研究不同，但均為肺癌患者，在CTC水平越高的患者其治療效果越差這一結(jié)論上具有一致性。Wang等[7]研究結(jié)果顯示，在接受放化療治療的SCLC患者中CTC呈高表達(dá)提示不良預(yù)后，本研究結(jié)果與Wang 等的結(jié)果相似，但區(qū)別在于本研究未納入接受放療治療的患者。

本研究的局限性在于納入研究的時(shí)間較短且病例數(shù)偏少，今后需增加研究時(shí)間并聯(lián)合多中心進(jìn)行大樣本分析研究，以減少誤差；此外，還應(yīng)進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)患者的無進(jìn)展生存期及中位生存期，以分析CTC表達(dá)水平與SCLC患者生存時(shí)間之間的關(guān)系，為CTC在SCLC患者診療中的臨床應(yīng)用提供更有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。