崔蕾蕾，夏愛華，王偉，邵可可(鹽城市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇鹽城 224001)

核酸檢測是新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)確診的重要手段。常用的核酸檢測方法有實時熒光RT-PCR、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的恒溫擴增、高通量測序、PCR-飛行時間質(zhì)譜、PCR-基因芯片[1-2]。為了解我國新型冠狀病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV；國際病毒分類委員會將2019-nCoV命名為SARS-CoV-2)核酸檢測的開展現(xiàn)狀及質(zhì)量狀況，幫助臨床實驗室發(fā)現(xiàn)檢測中存在的問題并進行改進，使得核酸檢測在疾病防控工作中更好地得到應(yīng)用，國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心于2020年3月16日—24日開展了2019-nCoV核酸檢測室間質(zhì)量評價活動，本實驗室參加了此次室間質(zhì)評活動，并用本實驗室使用的2種品牌提取儀、2種擴增試劑及2臺擴增儀組合出的8個檢測系統(tǒng)對質(zhì)評標(biāo)本進行檢測，以了解不同檢測系統(tǒng)的檢測能力差異，為實驗室選擇檢測試劑提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心于2020年3月16日—24日發(fā)放的12個2019-nCoV核酸檢測室間質(zhì)量評價樣本，編號分別為202001、202002、202003、202004、202005、202006、202007、202008、202009、202010、202011、202012。本次室間質(zhì)評樣本均為國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心制備，為基因工程方法制備的噬菌體病毒樣顆粒模擬樣本，無生物傳染危險性。

1.2儀器與試劑 32通道全自動核酸提取儀AU1001及磁珠法核酸提取試劑盒(無錫百泰克公司)(a)，全自動核酸提取儀SSNP-3000A及磁珠法核酸快速提取試劑盒(江蘇碩世公司)(b)，實時熒光定量PCR儀7300 Plus(美國ABI公司)(c)，實時熒光定量PCR儀CFX96(美國Bio-Rad公司)(d)，2019-nCoV核酸檢測試劑盒(熒光PCR法，上海伯杰公司)(e)，新型冠狀病毒(2019)核酸檢測試劑盒(熒光PCR法，江蘇碩世公司)(f)。

1.3方法

1.3.1RNA提取 用全自動核酸提取儀a及b及配套試劑分別提取12個質(zhì)評樣本，嚴(yán)格按照說明書進行提取。

1.3.2核酸擴增 分別用2019-nCoV核酸檢測試劑盒e及f，對2種提取儀提取的核酸，分別在擴增儀c及d上進行擴增，按照試劑盒說明書設(shè)置上機的擴增檢測參數(shù)和程序。由此分成下列檢測系統(tǒng)，A：b+f+d；B：b+e+d；C：b+f+c；D：b+e+c；E：a+f+d；F：a+e+d；G：a+f+c；H：a+d+c。

1.3.3質(zhì)量控制 每批次檢測設(shè)立1份弱陽性質(zhì)控及3份陰性質(zhì)控，陰性質(zhì)控隨機放在臨床樣本中。弱陽性質(zhì)控測定為陽性，3個陰性質(zhì)控結(jié)果全部為陰性，視為在控，否則為失控，不可發(fā)出報告，應(yīng)立即分析原因，必要時需重新檢測。

1.3.4結(jié)果分析與報告

1.3.4.1基線與閾值設(shè)定 根據(jù)分析后的熒光曲線進行參數(shù)的微調(diào)，基線取6～15個循環(huán)的熒光信號(每個檢測批次最先起跳的熒光曲線起跳前1～2個循環(huán)處)，閾值設(shè)定以閾值線剛好超過陰性質(zhì)控檢測熒光曲線的最高點。

1.3.4.2結(jié)果分析 有內(nèi)標(biāo)的試劑盒，先分析內(nèi)標(biāo)通道是否有擴增曲線，若有，表示本次檢測結(jié)果有效，可進行結(jié)果的分析；若待檢靶基因通道檢測到典型S型擴增曲線，且Ct≤設(shè)定閾值，表示該靶基因“檢出”；若“待測靶基因”通道未檢測到典型S型擴增曲線，或Ct>設(shè)定閾值，表示該靶基因“未檢出”。若內(nèi)標(biāo)通道未檢出Ct或Ct>設(shè)定值，表示本次檢測樣本濃度太低或者有干擾抑制反應(yīng)，須重新檢測。

1.3.4.3結(jié)果判斷 要確認(rèn)某病例為陽性，須滿足以下條件：同一份標(biāo)本中2019-nCoV至少2個靶標(biāo)(ORF1ab/N/E)實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果均為陽性。如1個靶基因陽性或檢測結(jié)果落在設(shè)置的灰區(qū)內(nèi)，標(biāo)本需進行復(fù)測或選用另1種試劑再測，如結(jié)果仍然可疑則須重新采樣(不同部位或不同樣本類型)進行檢測。2種試劑結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 不同核酸檢測試劑結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1提取試劑b提取核酸的檢測結(jié)果 提取試劑b提取的核酸分別用擴增試劑e和f，在擴增儀c及d上進行擴增，檢測結(jié)果Ct值見表2。

表2 快速提取試劑b提取核酸的Ct值

2.2提取試劑a提取核酸的檢測結(jié)果 提取試劑a提取的核酸分別用擴增試劑e和f，在擴增儀c及d上進行擴增，檢測結(jié)果Ct值見表3。

表3 提取試劑a提取核酸的Ct值

2.3各檢測系統(tǒng)實際檢測結(jié)果 12個室間質(zhì)評樣本中，202003及202009未納入統(tǒng)計指標(biāo)，其余10個樣本的預(yù)期檢測結(jié)果為5份2019-nCoV陽性，5份2019-nCoV陰性。8個檢測系統(tǒng)實際檢測結(jié)果見表4。8個檢測系統(tǒng)均檢測出202004、202008、202011，均未檢出202010(128 copies/mL)；對202002(640 copies/mL)，只有B及D 2個檢測系統(tǒng)檢出，其余均未檢出。

表4 各檢測系統(tǒng)實際檢測結(jié)果與預(yù)期檢測結(jié)果比較

2.4不同檢測系統(tǒng)對陽性結(jié)果各靶區(qū)域的檢測情況 2種擴增試劑擴增的靶區(qū)域相同，均為ORF1ab及N基因，8個檢測系統(tǒng)對2個靶區(qū)域的檢測結(jié)果見表5、表6。N基因的檢測發(fā)現(xiàn)，8個檢測系統(tǒng)對于病毒載量高的樣本的檢測能力相同，主要區(qū)別在于對病毒拷貝數(shù)低的樣本的檢測能力存在差異，B及D檢測系統(tǒng)優(yōu)于其他檢測系統(tǒng)，起主導(dǎo)作用的主要是B及D 2個檢測系統(tǒng)所使用的e擴增試劑的檢測能力優(yōu)于A及C檢測系統(tǒng)所使用的f擴增試劑。對于ORF1ab基因檢測發(fā)現(xiàn)，A-D檢測系統(tǒng)檢測到的ORF1ab基因的陽性率高于E-H檢測系統(tǒng)，A-D檢測系統(tǒng)均使用的是b快速提取試劑，而E-H檢測系統(tǒng)使用的是a提取試劑，提取試劑的提取效率對檢測結(jié)果影響較大。

表5 不同檢測系統(tǒng)陽性結(jié)果的ORF1ab靶區(qū)域檢測情況

表6 不同檢測系統(tǒng)陽性結(jié)果的N靶區(qū)域檢測情況

3 討論

本次室內(nèi)質(zhì)評的5份陽性樣本中，要求實驗室能夠檢出202011(8×104copies/mL)、202008(1.6×104copies/mL)、202004(3.2×103copies/mL)、202002(640 copies/mL)4個濃度水平的樣本。8個檢測系統(tǒng)均檢測出202004、202008、202011；主要的問題存在于對640 copies/mL弱陽性樣本檢出能力。由于202002(640 copies/mL)病毒拷貝數(shù)均低于f擴增試劑及e擴增試劑的檢測下限，8個檢測系統(tǒng)中，只有B及D 2個檢測系統(tǒng)檢出，其余均未檢出。B及D檢測系統(tǒng)中，提取試劑均為b快速提取試劑，擴增試劑均為e擴增試劑，擴增儀分別為c及d，提取試劑及擴增儀相同的A及C檢測系統(tǒng)卻未檢出，說明其差別主要在于擴增試劑不同，2種擴增試劑均使用實時熒光RT-PCR 法，雖然2種檢測試劑聲稱的分析靈敏度均為1 000 copies/mL ，但從實驗結(jié)果來看，2種試劑的分析靈敏度存在差異。擴增試劑e各陽性樣本檢測的符合率總體優(yōu)于f擴增試劑。導(dǎo)致檢測假陰性的原因涉及核酸提取和檢測2個過程。

本實驗室使用的核酸提取方法為自動化儀器+磁珠提取法，使用的核酸提取試劑種類為2種。2種核酸提取試劑的磁珠吸附效率、用于核酸提取的樣本量、洗脫體積也各有不同，因此，即使2種提取試劑磁珠吸附效率相同，提取核酸濃度亦不相同。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性標(biāo)本經(jīng)提取試劑b提取的靶基因檢出率高于提取試劑a，同時其Ct值亦較a低。

目前，多數(shù)試劑廠家選擇2019-nCoV核酸序列的2個或2個以上的區(qū)域進行檢測，ORF1ab、N區(qū)和E區(qū)是常見的檢測區(qū)域[3]。本實驗室使用的2種擴增試劑都是檢測ORF1ab、N區(qū)，不同靶區(qū)域的敏感性也存在差異。本次室間質(zhì)評樣本為ORF區(qū)和N區(qū)連接在一起的病毒樣顆粒，因此ORF和N區(qū)的數(shù)量完全一致，但是2種擴增試劑對2個區(qū)域檢測的陽性率差異明顯?？偟膩碚f，N區(qū)的陽性率高于ORF區(qū)，病毒拷貝數(shù)越低，這一現(xiàn)象越顯著。

本次室間質(zhì)評含有5份2019-nCoV陰性樣本，主要考核檢測的特異性以及是否存在實驗室污染。從實驗結(jié)果來看，8個檢測系統(tǒng)對5份陰性樣本均為未檢出，與預(yù)期結(jié)果相符，未發(fā)現(xiàn)假陽性，說明本室使用的2種擴增試劑與其他冠狀病毒無交叉反應(yīng)。

本研究使用的樣本為基因工程方法制備的噬菌體病毒樣顆粒模擬樣本，與人體標(biāo)本基質(zhì)不同，可能導(dǎo)致不同核酸提取試劑對其處理能力的不同而使得結(jié)果產(chǎn)生差異，結(jié)果不能完全代表實際檢測結(jié)果。另外，本研究僅僅對各試劑某一批號的檢測能力作了簡要比較分析，并且由于樣本數(shù)量有限，也不能完全代表試劑的總體檢測性能。因缺乏2019-nCoV核酸陽性樣本，如有條件，應(yīng)使用陽性樣本代替室間質(zhì)評樣本，同時擴大樣本數(shù)量，進一步對核酸提取試劑的提取質(zhì)量、檢測試劑性能等指標(biāo)進行有效評價。

實驗室應(yīng)盡量選用配套檢測系統(tǒng)，如選用非配套系統(tǒng)，應(yīng)該對配套系統(tǒng)與非配套系統(tǒng)進行比對，確保所選用的檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時，實驗室應(yīng)使用參與核酸提取過程的弱陽性樣本和多份(如 3 份)陰性樣本，進行室內(nèi)質(zhì)量控制，以有效監(jiān)測實驗室對弱陽性樣本的檢測能力和實驗室污染；還應(yīng)加強人員實驗操作和結(jié)果解讀能力的培訓(xùn)。