孫范忱， 郭 靜,2， 于 躍,2， 張 森,2

(1. 大連工業(yè)大學(xué) 紡織與材料工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034； 2. 遼寧省功能纖維及復(fù)合材料工程技術(shù)中心， 遼寧 大連 116034)

人體創(chuàng)傷發(fā)生的頻率逐年增加[1-2]，其中外周神經(jīng)損傷約占5%，神經(jīng)修復(fù)成為急需解決的重要問(wèn)題[3-4]。常用的神經(jīng)修復(fù)方法是自體移植，其受到來(lái)源、供區(qū)缺損和供需不匹配等限制，因此，人造神經(jīng)導(dǎo)管材料應(yīng)運(yùn)而生[5-6]。

聚羥基脂肪酸酯(P(3HB-co-4HB))是通過(guò)微生物發(fā)酵獲得的可降解材料，其生物相容性、可塑性、韌性等性能較為突出，所以在農(nóng)業(yè)、包裝、生物學(xué)及組織工程領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[7-8]，但由于P(3HB-co-4HB)表面缺乏活性功能基團(tuán)，使細(xì)胞膜與其接觸時(shí)產(chǎn)生特異性相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞在材料表面粘附、遷移、增殖受到一定限制。為解決這一問(wèn)題，劉琴等[9]通過(guò)制備同軸P(3HB-co-4HB)/聚乙烯醇復(fù)合支架來(lái)改善其生物相容性；Wang等[10]通過(guò)調(diào)解共混物中聚乳酸(PLA)的含量制得了具有高孔隙率、高吸水性的P(3HB-co-4HB)/PLA材料，并用于軟骨組織培養(yǎng)。

海藻酸鈉是從海中提取的一種天然多糖類化合物，是β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)按(1→4)鏈連接而成。其生物相容性好，親水性優(yōu)良，有利于細(xì)胞的粘附、增殖和分化[11-12]，但單一SA剛性大，耐水性差，很難靜電紡絲成形[13-14]。將P(3HB-co-4HB)和SA共混可在性能上實(shí)現(xiàn)取長(zhǎng)補(bǔ)短。然而P(3HB-co-4HB)為親油性，SA為親水性，在常規(guī)情況下很難共溶解，為此，本文以月桂基葡糖苷(APG)為乳化劑，成功將P(3HB-co-4HB)與SA復(fù)合，制備了P(3HB-co-4HB)/SA納米纖維，并對(duì)納米纖維的表面形貌、孔隙率、毒性、生物相容性等進(jìn)行表征。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

原料與試劑：海藻酸鈉(SA)，相對(duì)分子質(zhì)量為15 000，其中G片段與M片段比例為1.2∶1，青島海之林生物有限公司； P(3HB-co-4HB)，數(shù)均分子量約為7×105，其中4HB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，山東意可曼科技有限公司；三氯甲烷，分析純，西隴化工股份有限公司； 烷基糖苷(APG)，山東優(yōu)索化工科技有限公司；RSC96血旺細(xì)胞，廣州吉妮歐生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK8)，合肥新恩源生物技術(shù)有限公司；乙醇(75%)，鐵嶺康泰消毒劑有限公司；戊二醛，分析純，北京索萊寶科技有限公司；叔丁醇，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，北京索萊寶科技有限公司。

儀器：Spectrum-One B型紅外光譜儀,美國(guó)PE公司；DSC200F3型差示掃描量熱儀,德國(guó)耐馳儀器制造有限公司；JSM-7800F型掃描電子顯微鏡(SEM),日本電子(JEOL)；TL-Pro-BM型高壓靜電紡絲機(jī),深圳市通力微納科技有限公司；VD-850型桌上式潔凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀，上海沛歐分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

本文實(shí)驗(yàn)機(jī)制和實(shí)驗(yàn)過(guò)程如圖1所示。首先將SA溶于去離子水中配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%)的SA水溶液。然后將含有一定比例的APG和三氯甲烷加入到SA水溶液中，使APG起到乳化作用，降低共混溶液的表面張力，隨后將共混溶液放置在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)上以400 W的功率均質(zhì)15 min，然后加入一定質(zhì)量的P(3HB-co-4HB)，放置于恒溫?fù)u床里連續(xù)振蕩12 h，待P(3HB-co-4HB)完全溶解后，再次放在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)上以400 W的功率均質(zhì)15 min，使SA穩(wěn)定分布于P(3HB-co-4HB)溶液中得到紡絲溶液。最后通過(guò)靜電紡絲機(jī)進(jìn)行靜電紡絲，得到P(3HB-co-4HB)/SA納米纖維膜。紡絲條件：環(huán)境溫度為(35±1)℃，相對(duì)濕度為(20±5)%，靜電壓為20 kV，噴絲口距接收板距離為20 cm，流速為2.0 mL/h。

圖1 實(shí)驗(yàn)機(jī)制和實(shí)驗(yàn)過(guò)程Fig.1 Experimental process and analysis of co-dissolution mechanism

1.3 納米纖維膜化學(xué)結(jié)構(gòu)測(cè)試

采用紅外光譜儀測(cè)試P(3HB-co-4HB)/SA納米纖維膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)。將納米纖維粉末狀樣品用KBr壓片，掃描波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1。

1.4 納米纖維膜熱性能測(cè)試

采用差示掃描量熱儀測(cè)試樣品的熱性能，測(cè)試溫度范圍為-40～40 ℃，升溫速率為10 ℃/min，氮?dú)鈿夥铡?/p>

1.5 納米纖維膜表面形貌觀察

首先對(duì)纖維膜進(jìn)行噴金處理，然后采用掃描電子顯微鏡觀察樣品的表面形貌。加速電壓為10 kV，放大倍數(shù)為200～2 000倍。

1.6 納米纖維膜孔隙率測(cè)定

將3 cm×3 cm尺寸的纖維膜浸潤(rùn)于去離子水中20 min，取出用濾紙吸去膜表面水分，稱取質(zhì)量記為m1；然后將膜置于真空烘箱烘干至質(zhì)量恒定，稱取質(zhì)量，記為m2。用下式計(jì)算孔隙率：

式中：A為纖維膜表面積，cm2；Ld為膜厚，cm；ρ為去離子水的密度，取1 g/cm3。

1.7 納米纖維膜的細(xì)胞毒性測(cè)試

采用浸提液法對(duì)生物醫(yī)用材料進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)。將稀釋好的RSC 96血旺細(xì)胞種植在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸出舊的培養(yǎng)液，換入新的培養(yǎng)液，然后分別加入納米纖維膜的浸提液，不加纖維膜的為空白組，在相同條件下分別培養(yǎng)12～96 h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在各孔中加110 uL的CCK8 培養(yǎng)基混合液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置30 min 后用酶標(biāo)儀在450 nm 下測(cè)定各孔的吸光度，取平均值并通過(guò)與對(duì)照組比較來(lái)判斷細(xì)胞的毒性，計(jì)算方法 ：細(xì)胞的相對(duì)增殖率P=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%。細(xì)胞毒性劃分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞相對(duì)增殖度大于等于100%為0級(jí)，75%～99%為1級(jí)，50%～74%為2級(jí)，25%～49%為3級(jí)，1%～24%為4 級(jí)，0為5 級(jí)。

1.8 體外細(xì)胞培養(yǎng)

為觀察細(xì)胞在材料上的粘附能力及形態(tài)，所有材料用75%乙醇浸泡5 min進(jìn)行消毒，然后用無(wú)菌PBS清洗，每次5 min，重復(fù)3次；隨后將材料放入細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔大約接種2×103個(gè)/mL的RSC96血旺細(xì)胞，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h作為掃描電鏡觀察的標(biāo)本，待培養(yǎng)時(shí)間到達(dá)后，先吸出舊培養(yǎng)液，然后用PBS洗3次，再用4%戊二醛固定4 h，隨后進(jìn)行乙醇梯度脫水各10 min、50%叔丁醇和純叔丁醇各處理10 min，最后用凍干機(jī)冷凍干燥，噴金后用掃描電鏡觀察其表面形貌。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

圖2 為SA、P(3HB-co-4HB)和P(3HB-co-4HB)/SA(SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%)纖維膜的紅外光譜圖?？梢钥闯觯篠A在1 624和1 416 cm-1處存在明顯的吸收特征峰，為SA大分子六元環(huán)上COO-的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰和對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，在3 435 cm-1處為O—H伸縮振動(dòng)峰[14]；P(3HB-co-4HB)的酯基峰在1 726 cm-1處，羰基峰在1 340和1 186 cm-1處；P(3HB-co-4HB)/SA纖維膜的特征峰基本上是SA和P(3HB-co-4HB)吸收峰的加和，沒有明顯新峰出現(xiàn)，說(shuō)明二者以共混為主，但觀察可發(fā)現(xiàn)纖維膜在3 435 cm-1處的羥基的吸收峰強(qiáng)度變大，峰變窄，這是由于SA中存在大量羥基、羧酸基，P(3HB-co-4HB)存在大量的酯基，APG也存在大量的羥基和醚基，三者之間易形成如圖3所示的氫鍵作用，正是這種氫鍵作用保證了溶液的均勻穩(wěn)定。

圖2 SA、P(3HB-co-4HB) 和P(3HB-co-4HB)/SA的 紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of SA，P(3HB-co-4HB) and P(3HB-co-4HB)/SA composites

圖3 氫鍵結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Schematic diagram of hydrogen bonding

2.2 相容性分析

圖4示出P(3HB-co-4HB)和P(3HB-co-4HB)/SA (SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%)纖維膜的差示掃描量熱(DSC)曲線。可以看出，P(3HB-co-4HB)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為-12.09 ℃，P(3HB-co-4HB)/SA纖維膜出現(xiàn)2個(gè)玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，分別為-12.09和-4.37 ℃。原因可能是：P(3HB-co-4HB)與SA為不相容體系，可借助乳化劑APG形成穩(wěn)定溶液，但在成形過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生微相分離，其中一相為P(3HB-co-4HB)，對(duì)應(yīng)玻璃化轉(zhuǎn)變溫度-12.09 ℃；另一相為P(3HB-co-4HB)與SA的復(fù)合相，對(duì)應(yīng)玻璃化轉(zhuǎn)變溫度-4.37 ℃，產(chǎn)生復(fù)合相的原因是SA分子剛性較強(qiáng)，其可發(fā)生相對(duì)分子質(zhì)量的伸展，但不能有效的形成鏈纏結(jié)，導(dǎo)致空間位阻變大，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度升高。由此可推斷，APG實(shí)現(xiàn)了P(3HB-co-4HB)與SA的部分相容。

圖4 P(3HB-co-4HB)和P(3HB-co-4HB)/SA的DSC曲線Fig.4 DSC curves of P (3HB-co-4HB) and P(3HB-co-4HB)/ SA

2.3 纖維形貌和孔隙率分析

圖5示出P(3HB-co-4HB)/SA納米纖維膜的掃描電鏡照片。表1為其相對(duì)應(yīng)的直徑和孔隙率測(cè)試結(jié)果。由圖5和表1可知，在SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于或等于8%時(shí)，P(3HB-co-4HB)/SA纖維的直徑隨著SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高而增大，之后隨SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大有減小趨勢(shì)，當(dāng)SA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時(shí)，纖維形態(tài)最好，纖維直徑分布比較均勻集中，沒有明顯的珠?，F(xiàn)象，纖維的平均直徑為500 nm。當(dāng)SA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于8%時(shí)，纖維出現(xiàn)明顯的異質(zhì)化、斷絲和纏結(jié)，這是由于SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高，體系黏度增大，分化作用減小、可紡性變差。由表1還可見，纖維膜的孔隙率隨著SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化呈現(xiàn)先減小后增大趨勢(shì)，在SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)達(dá)到最大值89%，這是因?yàn)橹睆奖容^小的纖維具有大的比表面積，更易產(chǎn)生芯吸效應(yīng)，從而吸附水分子，使孔隙率變大。但當(dāng)SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%時(shí)，因?yàn)樾纬闪诉^(guò)多的珠粒，占據(jù)了較大的體積，所以導(dǎo)致纖維膜孔隙率有所下降。高的孔隙率有利于細(xì)胞的培養(yǎng)，同時(shí)也可作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及新陳代謝的通道。

圖5 不同SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)纖維膜的掃描電鏡照片(×5 000)Fig.5 SEM images of fiber membrane with different SA mass fractions(×5 000)

表1 不同SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)纖維膜的直徑和孔隙率Tab.1 Average diameter and porosity of fiber membrane with different SA mass fractions

2.4 細(xì)胞毒性分析

表2示出纖維膜對(duì)神經(jīng)細(xì)胞增殖影響。

表2 不同SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)纖維膜浸提液的吸光度值Tab.2 Optical density values of fiber membrane with different SA mass fractions

由表2可以看出，P(3HB-co-4HB)納米纖維雖然無(wú)毒，但其浸提液的分級(jí)幾乎都為1級(jí)，而P(3HB-co-4HB)/SA纖維膜浸提液的細(xì)胞相對(duì)增殖度均大于90%，為0級(jí)和少量的1級(jí)，不具有細(xì)胞毒性?？烧J(rèn)為P(3HB-co-4HB)/SA納米纖維具有良好的細(xì)胞相容性和生物安全性，能作為醫(yī)用材料。

2.5 細(xì)胞體外培養(yǎng)形貌分析

圖6為P(3HB-co-4HB)和添加不同SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)P(3HB-co-4HB)/SA纖維膜體外細(xì)胞培養(yǎng)掃描電鏡照片。對(duì)比可見，加入SA的膜的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞伸出了較多的偽足,且呈現(xiàn)出扁平的形態(tài)，緊密地貼附在材料表面。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因與P(3HB-co-4HB)/SA纖維膜中SA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)，即SA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，材料的生物相容性相對(duì)越好，越有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)、粘附。

圖6 不同SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)纖維膜的體外細(xì)胞培養(yǎng) 掃描電鏡照片(×500)Fig.6 SEM images of vitro cell culture of fiber membrane with different SA mass fractions(×500)

3 結(jié) 論

本文利用烷基糖苷(APG)成功地將聚羥基脂肪酸酯(P(3HB-co-4HB))和海藻酸鈉(SA)復(fù)合在一起，二者之間可形成穩(wěn)定的乳液。當(dāng)SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時(shí)，纖維平均直徑為500 nm，纖維表面致密光滑。與P(3HB-co-4HB)纖維膜相比，加入一定量SA的纖維膜的浸提液的分級(jí)均大于90%，毒性幾乎都為0級(jí)，不具有細(xì)胞毒性且可促進(jìn)細(xì)胞增長(zhǎng)的作用，SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，越有利于細(xì)胞在P(3HB-co-4HB)/SA納米纖維表面的生長(zhǎng)、粘附，P(3HB-co-4HB)/SA復(fù)合纖維膜較P(3HB-co-4HB)納米纖維膜有更好的細(xì)胞相容性和生物安全性。