張義浜，陳智峰，馬曉英

江蘇大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013

通過基因工程表達(dá)的抗原蛋白類疫苗在免疫機(jī)體時(shí)，往往還需要額外添加諸如氫氧化鋁或MF59等佐劑。已知蛋白類藥物可通過脂肪酸修飾，改善蛋白類藥物的脂溶性，提高與靶細(xì)胞的結(jié)合程度，從而延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期，降低用藥劑量，減少用藥頻率[1]。同樣地，如果將抗原蛋白進(jìn)行體外脂肪酸修飾，增強(qiáng)抗原蛋白的脂溶性，甚至誘導(dǎo)組裝形成復(fù)雜的納米結(jié)構(gòu)，使其不易被體內(nèi)的蛋白酶所降解破壞，延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期，從而提高被免疫細(xì)胞識(shí)別和吞噬的幾率，有望達(dá)到減少抗原和佐劑的接種量，降低疫苗副作用發(fā)生率等目的。

我們以卵清蛋白（ovalbumin，OVA）為模型抗原，擬采用化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)OVA的棕櫚酸化修飾，通過一系列體內(nèi)外研究，比較OVA經(jīng)棕櫚酸體外修飾前后在理化性質(zhì)和免疫方面的改變。

1 材料與方法

1.1 材料

卵清蛋白購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；棕櫚酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（棕櫚酸-NHS）購(gòu)自薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸銨（ANS）購(gòu)自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；BCA法蛋白定量試劑盒購(gòu)于碧云天生物科技公司；其他為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 OVA的棕櫚酸修飾反應(yīng)

根據(jù)OVA（1 mg/mL）（蛋白中的賴氨酸）與棕櫚酸-NHS的摩爾比2∶1、1∶1、1∶2分別進(jìn)行投料反應(yīng)，在OVA溶液中緩慢滴入棕櫚酸-NHS（溶于N，N-二甲基甲酰胺），室溫磁力攪拌反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液于12 000 r/min離心10 min，各取適量上清和沉淀部分進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3 pH對(duì)OVA棕櫚酸修飾反應(yīng)的影響

采用pH5～pH8的磷酸鹽緩沖液配成OVA溶液，各緩慢滴加棕櫚酸-NHS，室溫磁力攪拌1 h。反應(yīng)結(jié)束后12 000 r/min離心10 min，取適量上清液行SDS-PAGE分析，并采用BCA法進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。

1.4 棕櫚酸修飾卵清蛋白的疏水性分析（ANS熒光探針法）[2]

分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0 mL OVA溶液，各加入0.2 mL ANS（0.8 mmol/L）水溶液，補(bǔ)加磷酸緩沖液至4 mL；另設(shè)同濃度的ANS溶液作為空白對(duì)照組。溶液置搖床上避光振蕩15 min后熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)378 nm，掃描發(fā)射波長(zhǎng)400～600 nm?？瞻捉M的熒光強(qiáng)度設(shè)為零點(diǎn)，將蛋白濃度與對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度繪制成曲線，計(jì)算回歸方程，直線的斜率即為表面疏水值S0。

1.5 體外釋放

利用Franz擴(kuò)散池進(jìn)行OVA修飾前后在不同親疏水膜中滲透的差異對(duì)比，選取親水性的混合纖維素和聚砜醚（PES）膜，疏水性的PVDF膜，濾膜孔徑為0.45 μm。開啟透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀，溫度設(shè)為37℃；安裝好裝置后，加樣，攪拌，分別在0、0.5、1、1.5、2、3、6、12 h各時(shí)間點(diǎn)從接收池吸取一定量溶液，BCA法測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)接收池中的蛋白濃度。蛋白透過率（%）=（接收池蛋白濃度×接收池體積）/初始蛋白量×100%

1.6 動(dòng)物的免疫與血清采集

雌性昆明白小鼠（體重18～20 g）由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)組采用棕櫚酸修飾OVA分別經(jīng)皮下和肌肉注射，陰性對(duì)照組為肌肉注射OVA，肌肉注射OVA加鋁佐劑作為陽(yáng)性對(duì)照組，每組各免疫5只小鼠。接種量按OVA計(jì)算，每只5 μg。動(dòng)物初免后，每2周加強(qiáng)免疫一次，共免疫3次。初免后第14、28、42 d取免疫小鼠血清，ELISA法檢測(cè)特異性抗體滴度。

1.7 ELISA法測(cè)定小鼠血清抗體效價(jià)

用包被液（pH9.6的0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液）將OVA蛋白稀釋至1 μg/mL，96孔板包被，每孔 100 μL，4℃過夜，棄液體，用 PBST（含0.05% Tween-20的PBS溶液）洗滌3次，按200 μL/孔加入含0.5%牛血清白蛋白（BSA）（PBST配制）的封閉液，37℃封閉1 h，棄液體，PBST洗滌3次，加1∶10 000稀釋（用封閉液稀釋）的免疫小鼠血清，每孔 100 μL，37℃孵育 2 h；棄液體，PBST洗滌 3次，每孔加100 μL經(jīng)1∶3000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，37℃孵育30 min，PBST洗滌3次，每孔加100 μL TMB底物顯色液，37℃顯色20 min，每孔加50 μL反應(yīng)終止液（2 mol/L硫酸），酶標(biāo)儀選擇450 nm處掃板。若實(shí)驗(yàn)組D450nm值/陰性對(duì)照組D450nm值≥2.1，則結(jié)果判為陽(yáng)性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)為至少經(jīng)過3次以上實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以O(shè)ne-way ANOVA檢驗(yàn)組間差異，P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 投料比對(duì)修飾反應(yīng)的影響

通過改變OVA與棕櫚酸-NHS的投料比，對(duì)棕櫚酸修飾前后的OVA進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖1。比較原樣與反應(yīng)產(chǎn)物的上清液和沉淀樣品在電泳凝膠中的遷移情況，可以發(fā)現(xiàn)不同的投料比下，上清液樣品的電泳條帶基本與原樣的電泳條帶處于同一位置，而沉淀物的電泳條帶位置相對(duì)處于更低的位置，表明其在電泳過程中的遷移速度比反應(yīng)上清和原樣更快。從修飾效果來看，3種不同投料比的產(chǎn)物的電泳無明顯差異，考慮到棕櫚酸-NHS過量可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物中的雜質(zhì)量增加，因而選定投料摩爾比為1∶1。

2.2 pH值對(duì)修飾反應(yīng)的影響

采用ANS熒光探針檢測(cè)不同條件下修飾后蛋白的表面疏水性，OVA水溶液在激發(fā)波長(zhǎng)378 nm，掃描發(fā)射波長(zhǎng)400～600 nm，得到對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對(duì)OVA濃度做圖（圖2）。從圖2A可以看出，ANS自身的激發(fā)波長(zhǎng)為378 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm。當(dāng)OVA與ANS混合后，溶液的最大發(fā)射波長(zhǎng)藍(lán)移至474 nm。以最大發(fā)射波長(zhǎng)474 nm處的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)、蛋白濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見圖2B，計(jì)算得回歸方程y=569.83x+16.853，相關(guān)系數(shù)r2＞0.99，表明蛋白濃度與熒光強(qiáng)度具有良好的線性關(guān)系。當(dāng)ANS濃度為0.04 mmol/L，OVA濃度為0～1.125 mg/mL時(shí)可用于測(cè)定其表面疏水值S0。

基于以上結(jié)果，改變磷酸緩沖液的pH值，對(duì)棕櫚酸修飾OVA的產(chǎn)物分別進(jìn)行表面疏水值和蛋白含量的測(cè)定。從表面疏水值來看，在反應(yīng)液pH為5～8時(shí)（考慮到pH值過低或過高都不太利于保持蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定），隨pH值增大，修飾物的表面疏水值呈先增加后減小的趨勢(shì)，pH6時(shí)達(dá)到最大值（圖2C）。蛋白含量測(cè)定結(jié)果表明，不同pH值條件下的修飾產(chǎn)物中上清的蛋白含量與原樣相比，變化幅度不明顯。因此，采用pH6作為OVA棕櫚酸修飾反應(yīng)的最佳條件。

2.3 棕櫚酸修飾對(duì)OVA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圓二色譜（CD）分析結(jié)果見圖3。OVA經(jīng)棕櫚酸修飾前后，在190～195 nm處均有1個(gè)正峰，在鄰近的208、222 nm處有2個(gè)負(fù)峰，說明OVA所含的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋為主。OVA分別處于純水或pH6的磷酸緩沖液環(huán)境下，對(duì)CD譜無明顯影響；而OVA在經(jīng)棕櫚酸修飾后，除在205 nm左右處有1個(gè)小肩峰外，其產(chǎn)物上清的CD譜圖和修飾前基本無明顯變化，故認(rèn)為棕櫚酸修飾對(duì)OVA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)無明顯影響。

2.4 OVA棕櫚酸修飾物的體外釋放

圖1 OVA/棕櫚酸-NHS不同比例下修飾產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

圖2 蛋白表面疏水值測(cè)定

采用3種材料和性質(zhì)不同的微孔濾膜來比較修飾前后OVA的體外滲透差異，蛋白在不同膜中的體外累積滲透曲線結(jié)果見圖4?？梢钥吹?，蛋白在3種微孔濾膜中的累積透過量基本在2 h之內(nèi)達(dá)到峰值，其中OVA在親水膜PES中的透過非常迅速，加樣后0.5 h內(nèi)基本已達(dá)到100%；而經(jīng)過棕櫚酸修飾的OVA，12 h后在PES膜中的累積滲透率卻仍然不足40%，說明可能是由于修飾后的OVA與膜的相互作用較強(qiáng)，使得蛋白不易從膜中滲透入接收池中。

親水性混合纖維素膜中的累積透過率曲線與PES膜相反，未修飾的OVA未能在12 h內(nèi)全部滲透過濾膜，而修飾后的OVA能夠在3 h內(nèi)基本滲透過膜。該結(jié)果提示蛋白與2種親水性膜材料的相互作用程度不同。

當(dāng)采用疏水性的PVDF濾膜時(shí)，經(jīng)棕櫚酸修飾的OVA滲透得更快，且在3 h內(nèi)累積釋放率接近100%，而未修飾OVA的累積釋放率不足80%。

以上體外釋放實(shí)驗(yàn)從側(cè)面表明OVA經(jīng)過棕櫚酸修飾后，其性質(zhì)發(fā)生了不同程度的改變。

2.5 體內(nèi)免疫結(jié)果分析

圖3 不同反應(yīng)條件下所得OVA樣品的圓二色譜分析

根據(jù)圖5所示免疫后動(dòng)物血清中特異性抗體滴度的測(cè)定結(jié)果來看，實(shí)驗(yàn)組均比OVA組的滴度水平要高（均為P＜0.05）；但從接種方式來看，肌肉注射和皮下注射棕櫚酸修飾OVA的免疫效果差別不大。棕櫚酸修飾OVA雖然未能達(dá)到陽(yáng)性組（含鋁佐劑OVA）所產(chǎn)生的血清抗體滴度，但和未修飾OVA相比明顯提高，說明棕櫚酸修飾對(duì)蛋白的體內(nèi)過程產(chǎn)生了一定程度的影響，這可能是由于蛋白的棕櫚酸修飾改變了其理化性質(zhì)，尤其提高了蛋白的疏水性，增加對(duì)細(xì)胞膜的親和力，延長(zhǎng)了體內(nèi)半衰期，提高了免疫細(xì)胞的識(shí)別和提呈效率，從而在相同條件下刺激產(chǎn)生了濃度更高的特異性抗體。

3 討論

在真核生物體內(nèi)通過棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶作用實(shí)現(xiàn)蛋白的棕櫚?；揎?，是天然界中最為普遍且惟一可逆的脂質(zhì)修飾，與蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)、定位和功能發(fā)揮有關(guān)[3]。而感染宿主細(xì)胞的病毒，有些蛋白也會(huì)發(fā)生脂?；揎棧源龠M(jìn)病毒識(shí)別及進(jìn)入細(xì)胞，幫助病毒復(fù)制和組裝[4]。這些研究背景促使我們嘗試探討體外脂肪酸修飾對(duì)抗原蛋白體內(nèi)免疫的影響。

我們?cè)趯?duì)OVA進(jìn)行體外棕櫚酸修飾時(shí)，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)過程中溶液會(huì)變得渾濁，說明有水不溶物產(chǎn)生，因此在反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行了離心處理，觀察到在離心管底確有少量白色沉淀。后來嘗試在反應(yīng)體系中加入不同量的吐溫80或泊洛沙姆等表面活性劑，以期起到增溶效果，甚至還通過改用不同濃度乙腈作為反應(yīng)溶劑來改善不溶物的形成，但均收效甚微。

圖4 OVA經(jīng)棕櫚酸修飾前后在PES膜（A）、混合纖維素膜（B）、PVDF膜（C）的體外累積透過率

圖5 免疫42 d后小鼠血清中特異性抗體滴度檢測(cè)

對(duì)沉淀物的SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)其條帶明顯靠近相對(duì)分子質(zhì)量更低的位置，分析其原因很可能是由于沉淀物中OVA的棕櫚酸修飾程度相對(duì)更高，疏水性更強(qiáng)，從而在水溶液中的溶解度明顯降低，導(dǎo)致與去污劑十二烷基磺酸鈉（SDS）的結(jié)合量增加（同比未修飾蛋白的負(fù)電荷增加），故而在電場(chǎng)作用下遷移速度加快，因此并非是由于相對(duì)分子質(zhì)量降低導(dǎo)致。此現(xiàn)象及其原因在蛋白脂?；揎椀奈墨I(xiàn)中[5-7]未見涉及討論和研究，但可惜由于制備所得的沉淀物量少，且尚未能找到合適的溶劑來溶解沉淀物，因此難以對(duì)其做進(jìn)一步的分析研究和應(yīng)用。

另外，我們對(duì)棕櫚酸修飾后的OVA進(jìn)行了體外穩(wěn)定性研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)棕櫚酸修飾后的OVA溶液樣品在4℃冷藏條件下可穩(wěn)定保存至少1個(gè)月（通過對(duì)保存過程中蛋白含量測(cè)定、SDS-PAGE、表面疏水值測(cè)定等分析比較手段），該研究也從側(cè)面提示棕櫚酸修飾能夠提高抗原蛋白的穩(wěn)定性。

本研究初步確認(rèn)以蛋白和棕櫚酸-NHS投料摩爾比為1∶1，pH6的磷酸緩沖液為溶劑，對(duì)OVA進(jìn)行體外棕櫚酸修飾的效果最佳。通過棕櫚酸修飾，可顯著提高模型抗原OVA的表面疏水值和體外穩(wěn)定性。體內(nèi)免疫結(jié)果表明，OVA經(jīng)棕櫚酸修飾后，可在一定程度上提高免疫小鼠血清中特異性抗體的滴度。因此，我們認(rèn)為對(duì)蛋白類抗原的棕櫚酸修飾，可在不改變抗原二級(jí)結(jié)構(gòu)的前提下，通過提高抗原的表面疏水性，增強(qiáng)免疫效果，有助于減少疫苗抗原和佐劑的使用量。

后續(xù)，我們將繼續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，對(duì)OVA或其他模型抗原蛋白進(jìn)行不同脂肪酸修飾，比較不同脂肪酸修飾物對(duì)蛋白抗原免疫應(yīng)答的影響，探討其可能的分子作用機(jī)制。