亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        過(guò)表達(dá)miR-203對(duì)膿毒癥急性腎損傷大鼠的保護(hù)作用

        2021-01-05 08:40:14李啟成虞大為宗靜朱江磊徐東升王忠祥王詩(shī)波
        生物技術(shù)通訊 2020年5期
        關(guān)鍵詞:膿毒癥炎性試劑盒

        李啟成,虞大為,宗靜,朱江磊,徐東升,王忠祥,王詩(shī)波

        解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第904醫(yī)院 a.急診科;b.消化內(nèi)科;江蘇 無(wú)錫 214100

        膿毒癥是指由感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征,可累及多個(gè)系統(tǒng)和器官,進(jìn)而導(dǎo)致患者死亡[1]。其中,膿毒癥引起的急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,病死率高[2-3]。研究表明,AKI的早期發(fā)現(xiàn)及治療可減少患者的死亡[4]。

        微小RNA(microRNA,miRNA)是長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA[5],研究證實(shí)其影響人體內(nèi)關(guān)鍵代謝途徑[6]、病理進(jìn)程[7],進(jìn)而在細(xì)胞增殖、分化、凋亡及應(yīng)激反應(yīng)[8]等方面發(fā)揮重要作用。miR-203在不同的器官組織、腫瘤中具有差異性表達(dá),例如膀胱癌[9]、胃癌[10]、大腸癌[11]、肺癌[12]、乳腺癌[13]等,但目前鮮有報(bào)道m(xù)iR-203的異常表達(dá)與膿毒癥大鼠急性腎損傷間的關(guān)系。本研究將探討miR-203對(duì)膿毒癥大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用,以期為臨床早期干預(yù)膿毒癥急性腎損傷提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        健康的SPF級(jí)雄性成年SD大鼠購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(豫)2014-0002],體重200±50 g,于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室用無(wú)菌水和飼料飼養(yǎng)1周后進(jìn)行造模處理。

        Keygen Trans新型轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;miRNA qRT-PCR檢測(cè)試劑盒、cDNA合成試劑盒購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司;改良HE染色試劑盒、高效RIPA裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;miR-203 agomir、agomir-NC由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成;大鼠肌酐(Cr)ELISA定量檢測(cè)試劑盒、大鼠尿素氮(BUN)ELISA試劑盒、大鼠腎損傷分子1(KIM-1)ELISA試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司;大鼠中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)ELISA試劑盒購(gòu)自上??道噬锟萍加邢薰?;大鼠白介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒購(gòu)自安徽經(jīng)科生物技術(shù)有限公司;大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司;β-actin抗體(ab6276,小鼠單克隆抗體)、Toll樣受體4(TLR4)抗體(兔多克隆抗體)、磷酸化p65(p-p65)抗體(兔多克隆抗體)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)、山羊抗小鼠IgG H&L(HRP)購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司;磷酸化NF-κB(p-IκBα)抗體(小鼠單克隆抗體)購(gòu)自美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)分組及建模

        將40只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、miR-203 agomir組、agomir-NC組,每組10只,通過(guò)盲腸結(jié)扎穿刺法(CLP)建立膿毒癥大鼠模型。miR-203agomir、agomir-NC組模型建立后分別尾靜脈注射miR-203 agomir和agomir-NC,每次10 nmol/L,模型組和假手術(shù)組注射等量的生理鹽水,24 h后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)變化情況。

        1.3 RT-qPCR檢測(cè)miR-203表達(dá)水平

        提取大鼠腎組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,RT-qPCR測(cè)定miR-203表達(dá)水平,U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)。miR-203正向引物為5′-ACACTCCAGCTGGGGTGAAATGTTTA-3′,反向引物為 5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′;U6 正向引物為 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 15 min,然后按 95℃ 5 s、60℃ 30 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。

        1.4 ELISA檢測(cè)血清腎功能指標(biāo)、腎損傷指標(biāo)、炎性指標(biāo)

        收集全血標(biāo)本,4℃、1000 r/min離心20 min,收集上清。將ELISA檢測(cè)試劑盒于室溫條件下平衡20 min,標(biāo)準(zhǔn)孔中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL,樣本孔中加入待測(cè)樣本50 μL;每孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃孵育60 min;棄上清,加入350 μL洗滌液,室溫孵育1 min;棄上清,上述步驟重復(fù)5次;每孔加入底物A、B各50 μL,37℃避光孵育15 min;每孔加入50 μL終止液,用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的D450nm值。

        1.5 HE染色觀察各組大鼠腎組織病理變化

        SD大鼠造模成功24 h后麻醉處死。取腎組織,4%多聚甲醛固定后進(jìn)行梯度無(wú)水乙醇脫水,石蠟包埋,切片,脫蠟,用蘇木精-伊紅溶液染色,脫水,中性樹(shù)脂封片。光學(xué)顯微鏡觀察大鼠腎組織的病理變化。

        1.6 Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

        組織勻漿后用RIPA裂解液提取各標(biāo)本的總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE。轉(zhuǎn)PVDF膜后加入5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉,然后加入一抗(1∶1000),4℃過(guò)夜孵育;加入二抗(1∶3000),室溫孵育1 h;洗膜后用ECL發(fā)光液顯影,采用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

        1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        采用SPSS 20.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示,多組數(shù)據(jù)之間比較采用F檢驗(yàn),組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠miR-203表達(dá)水平

        與假手術(shù)組比,模型組和agomir-NC組大鼠腎組織miR-203表達(dá)水平顯著下降(P<0.05);與agomir-NC組比,miR-203 agomir組大鼠腎組織miR-203表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),提示轉(zhuǎn)染成功(圖1)。

        2.2 各組大鼠血清中腎功能及腎損傷標(biāo)志物含量

        與假手術(shù)組比,模型組和agomir-NC組大鼠血清Cr、BUN、NGAL、KIM-1含量均顯著升高(F值依次為36.249、124.320、38.819、260.307,P<0.05);與agomir-NC組比,miR-203 agomir組大鼠血清Cr、BUN、NGAL、KIM-1含量均顯著下降(t值依次為5.650、8.559、7.498、16.797,P<0.05)(圖2)。

        2.3 各組大鼠血清炎性因子含量

        與假手術(shù)組比,模型組和agomir-NC組大鼠血清TNF-α、IL-1β含量均顯著升高(F值分別為248.561、91.946,P<0.05);與agomir-NC組比,miR-203 agomir組大鼠TNF-α、IL-1β含量均顯著下降(t值分別為16.926、7.516,P<0.05)(圖3)。

        2.4 各組大鼠腎組織病理變化

        假手術(shù)組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常;模型組和agomir組大鼠腎組織細(xì)胞水腫,伴有炎性浸潤(rùn)、腎小球皺縮、腎小管閉塞;miR-203 agomir組大鼠腎組織水腫、炎性浸潤(rùn)以及腎小球和腎小管病變情況均得到緩解(圖4)。

        2.5 miR-203對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響

        與假手術(shù)組比,模型組和agomir-NC組大鼠腎組織 TLR4、p-p65、p-IκBα蛋白表達(dá)水平顯著升 高(P<0.05);與 agomir-NC 組 比 ,miR-203 agomir組大鼠腎組織TLR4、p-p65、p-IκBα蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)(圖5)。

        圖1 各組大鼠miR-203表達(dá)水平

        圖2 各組大鼠血清中腎功能及腎損傷標(biāo)志物含量

        3 討論

        圖3 各組大鼠血清炎性因子含量

        30%~50%膿毒癥患者會(huì)發(fā)生膿毒癥急性腎損傷,這是常見(jiàn)的并發(fā)癥之一,具有病情危重、臨床治療不佳、致死率高等特征[14]。已有研究表明,異常表達(dá)的miR-203在多種類(lèi)型的癌癥中扮演著抑癌的角色。Shen等[9]發(fā)現(xiàn)miR-203可能通過(guò)負(fù)調(diào)控組織轉(zhuǎn)錄因子Twist同系物1(Twist1)而在膀胱癌細(xì)胞中充當(dāng)腫瘤抑制性miRNA。Du等[11]研究表明miR-203通過(guò)靶向重組人帕金森病蛋白7(DJ-1,PARK7)抑制大腸癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Chen等[15]發(fā)現(xiàn)miR-203通過(guò)靶向脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4)抑制肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本研究通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)各組大鼠腎組織miR-203表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比,模型組和agomir-NC組大鼠腎組織miR-203表達(dá)水平顯著下降;與agomir-NC組比,miR-203 agomir組大鼠腎組織miR-203表達(dá)水平顯著升高。這提示miR-203在膿毒癥急性腎損傷發(fā)生發(fā)展中扮演著抑癌作用。

        HE染色結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比,模型組和agomir-NC組大鼠腎組織細(xì)胞水腫,且伴有炎性浸潤(rùn)、腎小球皺縮;過(guò)表達(dá)miR-203后,腎組織水腫、炎性浸潤(rùn)及腎小球皺縮均得到顯著改善。Cr和BUN是判斷腎功能損害的重要指標(biāo),在急性腎損傷中高表達(dá)[16];KIM-1和NGAL是急性腎損傷的重要生物標(biāo)志物,在急性腎損傷早期高表達(dá)[17]。Han等[18]研究表明虎杖和肉桂通過(guò)降低Cr、BUN、NGAL、KIM-1水平并抑制肝黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)表達(dá)進(jìn)而改善高尿酸血癥大鼠生物腎臟功能。通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)觀察各組大鼠腎功能指標(biāo)Cr與BUN的變化,結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比,模型組和agomir-NC組血清Cr、BUN、NGAL、KIM-1水平均顯著升高;過(guò)表達(dá)miR-203后,血清 Cr、BUN、NGAL、KIM-1水平均顯著下降。這提示miR-203能夠降低膿毒癥急性腎損傷的腎功能損害程度。

        圖4 各組大鼠腎組織病理變化(200×)

        圖5 miR-203對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響

        IL-1β和TNF-α是膿毒癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的重要炎性因子,是反映機(jī)體炎癥程度的指標(biāo)[19]。本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比,血清IL-1β、TNF-α水平均顯著升高;過(guò)表達(dá)miR-203后,血清IL-1β、TNF-α水平均顯著下降。這提示miR-203可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

        王彬等[20]研究表明,在實(shí)驗(yàn)性重度急性胰腺炎組織中的TLR4、NF-κB p65表達(dá)變化與腎損傷嚴(yán)重程度和促炎因子的變化一致。Zhang等[21]研究表明Tec激酶的負(fù)調(diào)控通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性腎臟損傷。Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)棕櫚酸通過(guò)激活 TLR4/Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子(KLF7)/NF-κB炎性信號(hào)促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)。Li等[23]研究表明紅景天苷通過(guò)抑制TLR4/NF-κB和MAPK信號(hào)通路,并減少炎性細(xì)胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α的釋放,進(jìn)而改善腎間質(zhì)纖維化。李登等[24]研究表明miR-203通過(guò)下調(diào)TLR4-Myd88-NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化。本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比,模型組和agomir-NC組腎組織TLR4、p-p65、p-IκBα水平均顯著升高;過(guò)表達(dá)miR-203后,腎組織 TLR4、p-p65、p-IκBα水平均顯著下降。這提示miR-203對(duì)膿毒癥急性腎損傷的保護(hù)作用是通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路起作用的。

        綜上所述,本研究表明miR-203在膿毒癥急性腎損傷的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮一定的作用,miR-203在其中呈低表達(dá)水平,miR-203能夠抑制炎癥反應(yīng),對(duì)膿毒癥急性腎損傷大鼠起到保護(hù)作用,其機(jī)制可能與miR-203抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。miR-203可作為膿毒癥急性腎損傷中的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物,對(duì)臨床診斷及療效判定等方面具有重要的意義。

        猜你喜歡
        膿毒癥炎性試劑盒
        中西醫(yī)結(jié)合治療術(shù)后早期炎性腸梗阻的體會(huì)
        血清IL-6、APC、CRP在膿毒癥患者中的表達(dá)及臨床意義
        膿毒癥的病因病機(jī)及中醫(yī)治療進(jìn)展
        術(shù)后早期炎性腸梗阻的臨床特點(diǎn)及治療
        炎性因子在阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制中的作用
        膿毒癥早期診斷標(biāo)志物的回顧及研究進(jìn)展
        GlobalFiler~? PCR擴(kuò)增試劑盒驗(yàn)證及其STR遺傳多態(tài)性
        GoldeneyeTM DNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒的法醫(yī)學(xué)驗(yàn)證
        中西醫(yī)結(jié)合治療術(shù)后早期炎性腸梗阻30例
        牛結(jié)核病PCR診斷試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究
        欧美性群另类交| 特级av毛片免费观看| 亚洲看片lutube在线观看| 日日澡夜夜澡人人高潮| 红杏亚洲影院一区二区三区| 91av视频在线| 两个人看的www中文在线观看| 97久久综合区小说区图片专区| 精品一区二区三区中文字幕在线| 亚洲一区二区av免费观看| 中国黄色一区二区三区四区| 极品美女扒开粉嫩小泬图片| 97日日碰人人模人人澡| 国产va免费精品高清在线| 欧美日韩在线观看免费| 亚洲乱在线播放| 国内人妖一区二区在线播放| 久久中文字幕亚洲综合| 日日麻批免费40分钟无码| 亚洲av成人一区二区三区| 亚洲免费观看| 久久99精品久久久久久国产人妖| 国产精品久久婷婷六月| 东北老熟女被弄的嗷嗷叫高潮| 亚洲av中文无码乱人伦在线视色 | 女人一级特黄大片国产精品| 白白色发布视频在线播放| 亚洲天堂av在线网站| 国产大片黄在线观看| 一本加勒比hezyo无码人妻| 久久久精品电影| 成年男人午夜视频在线看| 国产av无码专区亚洲av麻豆| 亚洲熟女乱综合一区二区| 精品国产一级毛片大全| 粉嫩av一区二区在线观看| 久亚洲一线产区二线产区三线麻豆| 熟女中文字幕一区二区三区 | 99国语激情对白在线观看| 国产一区av男人天堂| 色五月丁香五月综合五月|