李琳 婺鳴 李冰，3，4? 張霞，3，4 徐丹

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.東莞理工學(xué)院，廣東 東莞 523000；3.華南理工大學(xué) 廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；4.華南理工大學(xué) 淀粉與植物蛋白深加工教育部工程研究中心，廣東 廣州 510640)

雜環(huán)胺(HAAs)是肉制品熱加工過程中氨基酸、糖與肌酐反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)危害產(chǎn)物，目前在日常飲食中已發(fā)現(xiàn)有30多種雜環(huán)胺[1]。根據(jù)雜環(huán)胺的結(jié)構(gòu)，可分為極性與非極性雜環(huán)胺兩類[2]。研究發(fā)現(xiàn)，雜環(huán)胺具有很強(qiáng)的致癌、致畸、致突變能力[3]，其中，2-氨基-3-甲基咪唑[4，5-f]-喹啉(IQ)被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IRAC)定義為可能致癌物(2A級(jí))，2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4，5-b]吡啶(PhIP)和2-氨基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚(AαC)被定義為潛在致癌物(2B級(jí))[4]。研究表明，雜環(huán)胺經(jīng)過體內(nèi)代謝活化后，其環(huán)外氨基能與DNA發(fā)生反應(yīng)并結(jié)合形成具有高度親電子活性的代謝終產(chǎn)物，從而對(duì)人體產(chǎn)生危害[5]。雖然雜環(huán)胺9H-吡啶并[3，4-b]吲哚(Norharman)結(jié)構(gòu)中不含有環(huán)外氨基，不會(huì)對(duì)DNA產(chǎn)生直接毒害，但Norharman的存在會(huì)顯著增強(qiáng)其他具有環(huán)外氨基的雜環(huán)胺的毒害性[6]。因此對(duì)于Norharman的研究也很有必要。

人血清白蛋白(HSA)是血漿中的一種重要載體蛋白，其與有害物的結(jié)合能力會(huì)影響到有害物在體內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和分布。鑒于此，對(duì)有害物與白蛋白之間的相互作用的研究將有助于了解有害物在人體內(nèi)的運(yùn)輸與分布[7]。牛血清白蛋白(BSA)是從牛血清中提取出的一種球蛋白，含有583個(gè)氨基酸殘基。BSA分子可被分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個(gè)結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域又可分為A、B兩個(gè)亞域。由于BSA與HSA結(jié)構(gòu)相似，具有76%的同源性，且價(jià)格更為低廉，因此，常被用作模型蛋白來研究小分子化合物與白蛋白的相互作用[8]。

本文選擇了兩種常見的雜環(huán)胺2-氨基-3-甲基咪唑[4，5-f]-喹啉(IQ)和9H-吡啶并[3，4-b]吲哚(Norharman)(結(jié)構(gòu)如圖1所示)作為研究對(duì)象，通過熒光光譜、同步熒光光譜、圓二色譜等多光譜方法研究它們?cè)谏項(xiàng)l件(pH=7.4)下與BSA的相互作用規(guī)律，以期通過Stern-Volmer方程和雙對(duì)數(shù)方程計(jì)算獲得淬滅機(jī)制、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和作用力類型等重要信息，并借助分子對(duì)接手段模擬相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)。本研究有助于了解雜環(huán)胺在體內(nèi)的運(yùn)輸、分布，為減少雜環(huán)胺對(duì)人體的危害提供一定參考。

圖1 雜環(huán)胺IQ與Norharman的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

2-氨基-3-甲基咪唑[4，5-f]-喹啉(IQ)和9H-吡啶并[3，4-b]吲哚(Norharman)雜環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)品：加拿大Toronto Research Chemicals公司；牛血清白蛋白(BSA)：98%，美國Sigma-Aldrich公司；二甲基亞砜：色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑：國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

F- 7000 FL熒光光譜儀：日本Hitachi公司；Chirascan圓二色譜儀：英國Applied Photophysics公司；FiveEasy pH計(jì)：美國Mettler Toledo公司；BS 224S天平：德國Sartorius公司；HH- 4水浴鍋：常州澳華儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 溶液的配制

稱取一定量BSA，溶于0.1 mol/L Tris-HCl溶液(pH=7.4)，配置濃度為1.5×10-3mol/L的儲(chǔ)備液；分別準(zhǔn)確稱取IQ和Norharman兩種雜環(huán)胺，溶于二甲基亞砜，配置濃度為5×10-3mol/L的儲(chǔ)備液；全部儲(chǔ)備液于4 ℃避光環(huán)境中存放。

1.3.2 熒光光譜測(cè)定與數(shù)據(jù)分析

將BSA儲(chǔ)備液用0.1 mol/L Tris-HCl溶液(pH=7.4)稀釋100倍，配置成濃度為1.5×10-5mol/L的BSA溶液；各雜環(huán)胺儲(chǔ)備液用二甲基亞砜稀釋，配置成濃度為5×10-5mol/L的工作溶液。準(zhǔn)確移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL雜環(huán)胺工作溶液于10 mL離心管中，加入1 mL BSA溶液，以Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L，pH=7.4)補(bǔ)足至5 mL，最后分別在298、308與310 K反應(yīng)5 min后進(jìn)行熒光光譜掃描和同步熒光光譜測(cè)定。在熒光光譜掃描模式下，激發(fā)波長λex=280 nm，λem=300～400 nm；在同步熒光光譜測(cè)定中，測(cè)定Δλ=15 nm下270～310 nm的熒光強(qiáng)度與Δλ=60 nm下250～310 nm的熒光強(qiáng)度。

根據(jù)某一溫度下不同雜環(huán)胺添加量處理后的蛋白熒光峰值，使用Stern-Volmer方程(1)來計(jì)算此溫度下的淬滅常數(shù)。使用雙對(duì)數(shù)曲線方程(2)來計(jì)算結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)。

(1)

log[(F0-F)/F]=logKA+nlog[Q]

(2)

1.3.3 圓二色光譜的測(cè)定

使用0.01 mol/L Tris-HCl溶液(pH=7.4)配置濃度為5×10-6mol/L的雜環(huán)胺溶液。向10 mL離心管中加入1 mL 1.5×10-5mol/L的BSA溶液，分別加入0.1、0.3、0.5和1.0 mL的雜環(huán)胺溶液，用Tris-HCl溶液(0.01 mol/L，pH=7.4)補(bǔ)足至 5 mL，置于310 K水浴加熱5 min，加入1 mm石英比色皿測(cè)量190～260 nm范圍內(nèi)的圓二色光譜。

1.3.4 分子對(duì)接模擬

使用Autodock 4.6軟件研究兩種雜環(huán)胺與BSA的模擬結(jié)合[10]。BSA的晶體結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫RCSB中獲得(編號(hào)3V03)，IQ和Norharman的結(jié)構(gòu)從網(wǎng)站(http：∥zinc.docking.org/)中下載。對(duì)各結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理，包括去水、去配體、加氫和點(diǎn)電荷計(jì)算。選擇結(jié)合能最低的一個(gè)結(jié)果，使用Ligplot軟件繪制2D分子對(duì)接圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種雜環(huán)胺與BSA的相互作用

2.1.1 雜環(huán)胺與BSA相互作用的熒光光譜圖

BSA中由于色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸的存在，使其具有內(nèi)源熒光[11]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與小分子發(fā)生相互作用時(shí)，色氨酸和酪氨酸殘基對(duì)于微環(huán)境變化十分敏感，進(jìn)而使得蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光發(fā)生變化。值得注意的是，許多雜環(huán)胺在260～275 nm處具有熒光吸收[12]，與BSA的激發(fā)波長280 nm十分接近，對(duì)熒光光譜結(jié)果有影響，因此，需以不含蛋白質(zhì)的等濃度雜環(huán)胺溶液作為空白對(duì)照。圖2是在生理環(huán)境(310 K，pH=7.4)下，BSA與不同濃度IQ和Norharman相互作用后的熒光光譜圖。當(dāng)激發(fā)波長為280 nm時(shí)，BSA在340 nm下具有熒光發(fā)射峰，并隨著兩種雜環(huán)胺的加入，發(fā)射峰強(qiáng)度均有所減小，發(fā)射峰的位置均發(fā)生了藍(lán)移。這表明，雜環(huán)胺能夠與BSA發(fā)生相互作用，導(dǎo)致了BSA的內(nèi)源熒光淬滅，并且熒光基團(tuán)的微環(huán)境發(fā)生了變化，疏水性增加，極性變小。此外，310 K下雜環(huán)胺IQ造成的內(nèi)源性熒光淬滅的強(qiáng)度要高于Norharman造成的熒光淬滅，這表明在生理?xiàng)l件下，IQ對(duì)BSA中的熒光基團(tuán)影響要高于Norharman，這種差異可能是分子極性的不同導(dǎo)致的。

圖2 雜環(huán)胺IQ、Norharman與BSA在310 K下相互作用的熒光光譜圖

2.1.2 雜環(huán)胺對(duì)BSA熒光淬滅的機(jī)理

熒光淬滅是內(nèi)源性熒光分子與淬滅分子發(fā)生相互作用而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低的過程，可主要分為動(dòng)態(tài)淬滅、靜態(tài)淬滅以及動(dòng)態(tài)和靜態(tài)的聯(lián)合淬滅[13]。動(dòng)態(tài)淬滅是由于熒光分子與淬滅分子發(fā)生碰撞，造成了能量轉(zhuǎn)移或電荷轉(zhuǎn)移，降低了熒光強(qiáng)度；靜態(tài)淬滅則是熒光分子與淬滅分子結(jié)合形成不發(fā)光的基態(tài)絡(luò)合物。溫度越高，分子碰撞越劇烈，而基態(tài)絡(luò)合物越不穩(wěn)定，因此動(dòng)態(tài)淬滅的淬滅常數(shù)隨溫度的升高而增大，靜態(tài)淬滅的淬滅常數(shù)隨溫度的升高而減小[14]。

假設(shè)兩種雜環(huán)胺與BSA的淬滅機(jī)理都是動(dòng)態(tài)淬滅，將各體系在各溫度下的熒光光譜結(jié)果分別代入方程(1)處理。以F0/F為縱坐標(biāo)，[Q]為橫坐標(biāo)繪圖，并擬合曲線，結(jié)果如圖3所示，不同溫度下雜環(huán)胺與BSA的Stern-Volmer常數(shù)則列于表1中。

從圖3可知，雜環(huán)胺IQ的Stern-Volmer曲線斜率隨著溫度的升高而增大；但由表1知，熒光淬滅常數(shù)Kq達(dá)到1012數(shù)量級(jí)，遠(yuǎn)大于生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞淬滅常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1，這表明IQ對(duì)BSA的熒光淬滅機(jī)理是動(dòng)態(tài)和靜態(tài)的聯(lián)合淬滅，且主要是動(dòng)態(tài)淬滅。雜環(huán)胺Norharman的Stern-Volmer曲線斜率隨著溫度的升高而減小，且表1中所求得的Kq遠(yuǎn)大于2.0×1010L·mol-1·s-1，因此Norharman對(duì)BSA的熒光淬滅機(jī)理為靜態(tài)淬滅。雖然Stern-Volmer模型也可用于單一靜態(tài)淬滅體系，但是此時(shí)動(dòng)態(tài)淬滅常數(shù)KSV沒有實(shí)際意義，因此更多考察熒光淬滅常數(shù)Kq的大小來評(píng)價(jià)淬滅效果[15]。兩種雜環(huán)胺淬滅機(jī)理不同應(yīng)該是由于IQ的分子極性大于Norharman，難以進(jìn)入被包埋在折疊后的BSA內(nèi)部的含有熒光基團(tuán)的疏水區(qū)域；且較大的分子體積進(jìn)一步削弱了IQ與BSA的結(jié)合親和力[16]。因此相較于Norharman，IQ與BSA更難以形成穩(wěn)定的基態(tài)絡(luò)合物。

圖3 雜環(huán)胺IQ、Norharman與BSA作用的Stern-Volmer曲線圖

2.1.3 雜環(huán)胺與BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)

使用雙對(duì)數(shù)方程(2)來處理熒光光譜結(jié)果，以計(jì)算相互作用的結(jié)合常數(shù)(KA)與結(jié)合位點(diǎn)(n)[17]。

表1 雜環(huán)胺與BSA作用的Stern-Volmer常數(shù)

以log [(F0-F)/F]為縱坐標(biāo)，log [Q]為橫坐標(biāo)作圖并擬合曲線。得到的結(jié)果如圖4及表2所示。

由圖4及表2可知，兩種雜環(huán)胺與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n均在1左右，故認(rèn)為雜環(huán)胺與BSA有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。IQ的結(jié)合常數(shù)隨著溫度的升高而增大，Norharman的結(jié)合常數(shù)隨著溫度的升高而減小。這也進(jìn)一步證實(shí)了IQ與BSA的熒光淬滅中主要是動(dòng)態(tài)淬滅，而Norharman與BSA的淬滅機(jī)理是靜態(tài)淬滅。

圖4 雜環(huán)胺IQ、Norharman和BSA作用的雙對(duì)數(shù)曲線圖

表2 雜環(huán)胺與BSA的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)

2.1.4 雜環(huán)胺與BSA結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)與作用力類型

小分子與蛋白質(zhì)相互作用，作用力類型一般包括疏水作用力、氫鍵、范德華力、靜電引力等。通過相互作用的熱力學(xué)參數(shù)可以判斷作用力類型：ΔH<0，ΔS<0時(shí)作用力為氫鍵和范德華力；ΔH>0，ΔS>0時(shí)作用力為疏水作用力；ΔH<0，ΔS>0時(shí)作用力為靜電引力[18]。當(dāng)溫度變化不明顯時(shí)，可以認(rèn)為反應(yīng)焓變?chǔ)是一常數(shù)。熱力學(xué)參數(shù)ΔH、ΔS和ΔG可由以下方程計(jì)算得到：

ln(K2/K1)=(1/T1-1/T2)ΔH/R

(3)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnK

(4)

計(jì)算得到的熱力學(xué)參數(shù)如表3所示。

表3 雜環(huán)胺與BSA結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)

由表3可知，兩種雜環(huán)胺與BSA的結(jié)合都是自發(fā)過程(ΔG<0)，IQ與BSA結(jié)合的ΔH>0，ΔS>0，可以認(rèn)為，IQ與BSA的分子間相互作用力是疏水作用力；而Norharman與BSA結(jié)合的ΔH<0，ΔS<0，可以認(rèn)為，該相互作用的作用力是氫鍵和范德華力。

2.2 雜環(huán)胺對(duì)BSA構(gòu)象變化的影響

2.2.1 同步熒光光譜

熒光基團(tuán)的最大發(fā)射波長與它所在的微環(huán)境極性有關(guān)，因此通過同步熒光光譜分析可以判斷氨基酸殘基所處環(huán)境的極性變化。在同步熒光光譜中，Δλ=15 nm的結(jié)果對(duì)應(yīng)了蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基的光譜性質(zhì)，Δλ=60 nm的結(jié)果對(duì)應(yīng)了蛋白質(zhì)中色氨酸殘基的光譜性質(zhì)[19]。同步熒光光譜結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，兩種雜環(huán)胺的加入均使酪氨酸和色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度有所降低。隨著IQ濃度的增加，酪氨酸和色氨酸殘基的最大發(fā)射波長均發(fā)生了輕微紅移。其中酪氨酸殘基最大發(fā)射波長紅移3 nm，色氨酸殘基最大發(fā)射波長僅紅移1 nm。這說明IQ的加入使得色氨酸和酪氨酸殘基的微環(huán)境極性增大，疏水性減??；且色氨酸殘基的微環(huán)境受到影響更小。添加Norharman的結(jié)果與IQ有所不同，Norharman濃度的增加使得酪氨酸殘基最大發(fā)射波長發(fā)生紅移，色氨酸殘基最大發(fā)射波長發(fā)生藍(lán)移。這表明Norharman的加入使得BSA中酪氨酸殘基微環(huán)境極性增大，疏水性減小；色氨酸殘基微環(huán)境極性減小，疏水性增大。

(a)IQ，Δλ=15 nm

(b)IQ，Δλ=60 nm

(c)Norharman，Δλ=15 nm

(d)Norharman，Δλ=60 nm

2.2.2 圓二色光譜

圓二色光譜技術(shù)可以用來檢測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。為了將雜環(huán)胺與BSA相互作用后蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化清楚的體現(xiàn)在圓二色光譜上，此處選擇了較高濃度的雜環(huán)胺以確保絕大部分的BSA都參與了相互作用。根據(jù)前文計(jì)算得到，雜環(huán)胺與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均為1，故選擇雜環(huán)胺濃度為蛋白質(zhì)濃度([BSA]=3×10-6mol/L)的0.00、0.33、1.00、1.67與3.33倍。圖6顯示的是在生理環(huán)境下(310 K，pH=7.4)，BSA與不同添加量的IQ或Norharman相互作用后在190～260 nm范圍內(nèi)的圓二色光譜。BSA分子的圓二色光譜分別在208 nm和222 nm處具有雙負(fù)峰形，這是典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)[20]。隨著兩種雜環(huán)胺加入到BSA中的比例增大，BSA分子在208 nm和222 nm 兩處的負(fù)峰明顯降低，且IQ實(shí)驗(yàn)組的降低量要大于Norharman實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果。這說明極性雜環(huán)胺IQ在此條件下對(duì)BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響要大于非極性雜環(huán)胺Norharman。

(a)IQ

(b)Norharman

對(duì)空白組及雜環(huán)胺添加量最高的一組使用CDNN 2.1軟件計(jì)算BSA中的各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，結(jié)果如表4所示。極性雜環(huán)胺IQ的添加能顯著減少BSA中α-螺旋的含量，非極性雜環(huán)胺Norharman也能減少α-螺旋的含量，但影響較小。結(jié)果說明雜環(huán)胺與BSA的結(jié)合破壞了原有蛋白質(zhì)的氫鍵結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致疏水性降低，肽鏈伸展，使α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低[21]。

表4 雜環(huán)胺添加對(duì)BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)比例的影響

2.3 分子對(duì)接模擬雜環(huán)胺與BSA的結(jié)合

分子對(duì)接技術(shù)可用于預(yù)測(cè)小分子與蛋白大分子之間的相互作用位點(diǎn)和結(jié)合自由能[10]。本研究中設(shè)置Grid Box范圍覆蓋整個(gè)BSA分子，通過結(jié)合能最低原則來判斷可能的結(jié)合位置。使用Ligplot軟件處理結(jié)合能最低的構(gòu)象并繪制2D圖。

由圖7可知，在結(jié)合能最低的構(gòu)象中，IQ與BSA上的Leu- 42、Glu- 45、Lys- 76、Ala- 78 4個(gè)氨基酸殘基存在疏水相互作用，并與Glu- 73存在氫鍵作用，另由Autodock的對(duì)接結(jié)果表明此時(shí)結(jié)合能為-5.44 kcal/mol；Norharman與Pro- 338存在氫鍵作用，并與Gln- 220、Tyr- 340、Val- 342、Glu- 443、Pro- 446、Asp- 450 共5個(gè)氨基酸殘基存在疏水相互作用，另由Autodock的對(duì)接結(jié)果表明此時(shí)結(jié)合能為-4.36 kcal/mol。在BSA分子的ⅡA和ⅢA亞域中存在兩個(gè)常見的小分子結(jié)合位點(diǎn)Site Ⅰ和Site Ⅱ。IQ的對(duì)接結(jié)果表明，結(jié)合能最低的作用位點(diǎn)位于結(jié)構(gòu)域Ⅰ中，與兩個(gè)小分子結(jié)合位點(diǎn)距離較遠(yuǎn)；而Norharman分子的結(jié)合能最低的作用位點(diǎn)接近Site Ⅱ。這也從側(cè)面解釋了兩種雜環(huán)胺對(duì)BSA淬滅機(jī)理的差異：IQ與BSA分子的結(jié)合位點(diǎn)與Site Ⅰ和Site Ⅱ不在一個(gè)結(jié)構(gòu)域中，且受到的疏水作用力也較少，而由2.1.4可知IQ與BSA相互作用的主要作用力為疏水作用力，因此兩者難以形成穩(wěn)定的基態(tài)絡(luò)合物，對(duì)BSA主要是動(dòng)態(tài)熒光淬滅；Norharman的結(jié)合位點(diǎn)則與Site Ⅱ在一個(gè)結(jié)構(gòu)域中，受到的疏水作用也更多，且由2.1.4可知主要相互作用力來自于氫鍵和范德華力，因此能與BSA生成穩(wěn)定的基態(tài)絡(luò)合物，對(duì)BSA產(chǎn)生了靜態(tài)熒光淬滅。

(a)IQ

(b)Norharman

3 結(jié)論

文中運(yùn)用熒光光譜、圓二色光譜方法考察了肉制品加工中兩種危害物雜環(huán)胺IQ及Norharman與BSA的相互作用。熒光光譜法的研究發(fā)現(xiàn)兩種雜環(huán)胺都能與BSA發(fā)生相互作用，淬滅內(nèi)源性熒光。其中，IQ的熒光淬滅機(jī)理為動(dòng)態(tài)和靜態(tài)的聯(lián)合淬滅，且主要是動(dòng)態(tài)淬滅，IQ與BSA的分子間相互作用主要是疏水作用力；Norharman對(duì)BSA的淬滅屬于靜態(tài)淬滅，結(jié)合力類型主要是氫鍵和范德華力。而同步熒光和圓二色光譜的研究結(jié)果則表明，兩種雜環(huán)胺與BSA之間的結(jié)合均導(dǎo)致了BSA構(gòu)象的改變，IQ引起的構(gòu)象改變程度要高于Norharman。此外，還用分子對(duì)接分別模擬了兩種雜環(huán)胺與BSA的結(jié)合。兩種雜環(huán)胺與BSA的結(jié)合機(jī)理有著很大不同，引起這一現(xiàn)象的原因應(yīng)該是兩種雜環(huán)胺的分子極性差異，但仍有待進(jìn)一步探索。這項(xiàng)研究將為以后雜環(huán)胺與人血清白蛋白結(jié)合的研究提供了理論基礎(chǔ)，有助于了解雜環(huán)胺在體內(nèi)的運(yùn)輸分布情況，為抑制雜環(huán)胺體內(nèi)的吸收提供一定參考。