李昌

（1 山東大學(xué)附屬山東省千佛山醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，山東 濟(jì)南；2滕州市中心人民醫(yī)院病理科，山東 滕州）

0 引言

有文獻(xiàn)報(bào)道，乳腺癌病變內(nèi)微鈣化的發(fā)生率高達(dá)30%-48%[1]。乳腺癌患者乳腺微鈣化與預(yù)后較差顯著相關(guān)[2]，但目前導(dǎo)致乳腺微鈣化的機(jī)制尚不清楚。碳酸酐酶Ⅰ（Carbonic anhydrase Ⅰ，CA Ⅰ）屬于碳酸酐酶（CA）家族成員，它能催化可逆性的CO2和H2CO3水合和脫水反應(yīng)[3]。

選取CA Ⅰ基因上的SNP 位點(diǎn)rs725605，通過(guò)對(duì)乳腺癌患者及健康人進(jìn)行TaqMan 基因分型。結(jié)果顯示：在等位基因和基因型頻率rs725605 上均與乳腺癌發(fā)生顯著相關(guān)（P＜0.05），在遺傳學(xué)上初步證實(shí)了CA Ⅰ是乳腺癌的易感基因。

我們檢測(cè)了乳腺腫瘤組織和患者血液樣本的CA Ⅰ的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 組織收集

所有組織樣本和血液樣本均來(lái)自山東大學(xué)附屬山東省千佛山醫(yī)院的患者（濟(jì)南，中國(guó)）。腫瘤組織學(xué)的病理診斷，根據(jù)WHO 腫瘤病理分類(lèi)系統(tǒng)進(jìn)行。研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。山東省千佛山醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)本項(xiàng)研究（參考編號(hào)2013012）。所有涉及人體受試者的研究（包括人體材料和人體數(shù)據(jù)）均符合《赫爾辛基宣言》的要求。

1.2 乳腺鉬靶攝影

采用美國(guó)GE 公司生產(chǎn)的鉬銠雙靶全屏數(shù)字化乳腺攝影機(jī)，機(jī)型為GE-Senographe2000DS，攝影體位為雙側(cè)乳腺頭尾位(CC)與內(nèi)外側(cè)斜(MLO)。由2名診斷經(jīng)驗(yàn)豐富的高年資主治醫(yī)師閱片，意見(jiàn)不一致時(shí)，通過(guò)討論達(dá)成一致。

1.3 SNP 選擇和Taqman 基因分型

應(yīng)用TaqMan 技術(shù)對(duì)乳腺癌患者腫瘤組織進(jìn)行基因分型分析。乳腺癌(n=285,女性,平均47.65歲)，健康對(duì)照(n=285,平均38.42歲)。所有收集血液樣本均儲(chǔ)存于含3.8%檸檬酸鈉的抗凝管中。

使用Omega E-Z 96 Blood DNA kit(Omega,USA)試劑盒提取全血基因組DNA。使用ViiA 7 DX(Life Technology)進(jìn)行基因型分析。反應(yīng)在10ul 反應(yīng)體系中進(jìn)行：95℃變性10min，隨后50個(gè)循環(huán)（循環(huán)為95℃變性15s，60℃退火和延伸1min）。每個(gè)樣本的基因型通過(guò)Taqman 基因型軟件V1.2(Life Technology)測(cè)量等位基因-特異性熒光獲得。為確?；蛐蜏y(cè)定的精確性，每組設(shè)立重復(fù)樣本和陰性對(duì)照樣本。

1.4 免疫組織化學(xué)

Alenabio(中國(guó))公司購(gòu)得組織芯片切片，包含40例不同乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和8例不同正常乳腺組織。標(biāo)準(zhǔn)途徑對(duì)組織芯片進(jìn)行脫蠟和再水化，95℃檸檬酸鹽緩沖液（Sigma）中抗原修復(fù)10min。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶抑制劑（MaixinBio,China）室溫孵育30min。PBS 緩沖液沖洗，抗CA1 抗體4℃孵育過(guò)夜。TMS-P Kit(Maixin-Bio, China)免疫反應(yīng)。

1.5 ELISA

采集乳腺癌患者(n=92, 女90名，男2名;22-78歲,平 均53歲) 和健康 志愿者(n=84, 女82名，男2名;23-77歲, 平均52歲) 的血液樣本。4℃條件下3000g 離心10min，碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液5 倍稀釋?zhuān)?6-孔ELISA 酶標(biāo)板，4℃孵育過(guò)夜。PBST 清洗，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，抗CA Ⅰ抗體1:1000 稀釋加入96 孔板，室溫孵育2h，PBST 清洗，加入稀釋1000 倍的HRP 標(biāo)記的抗山羊總IgG(Sigma)，室溫孵育1h。PBST 洗板3次，TMB為底物顯色。讀取450nm 的吸光度值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS25.0 軟件分析數(shù)據(jù)。多重比較采用ANOVA分析。用t檢驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌組織樣本與對(duì)照組組織樣本之間的顯著性差異。P＜0.05 被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者鉬靶攝影圖像分析

乳腺浸潤(rùn)性癌多見(jiàn)分枝狀、短棒桿狀和細(xì)沙粒狀鈣化,成簇分布,導(dǎo)管內(nèi)癌多沿導(dǎo)管線狀鈣化。鈣化密度不均勻，直徑大多超過(guò)3cm，微鈣化灶數(shù)目多超過(guò)15 灶，伴有腫塊、結(jié)構(gòu)扭曲、毛刺征等惡性征象。乳腺纖維腺瘤見(jiàn)多發(fā)小點(diǎn)狀及環(huán)狀鈣化。

2.2 腫瘤患者rs725605 位點(diǎn)基因分型

SNPrs725605 的等位基因頻率(OR=0.722663,95% CI=0.570361-0.915634，P=0.007104)和基因頻率(P=0.029009)都與乳腺癌顯著相關(guān)。應(yīng)用Plink v1.07 軟件多元邏輯回歸分析，發(fā)現(xiàn)等位基因頻率和乳腺癌的相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察CA Ⅰ在乳腺癌組織中表達(dá)

40例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中有39例的CA Ⅰ顯著表達(dá)(約占97.5%)。正常乳腺組織中CA Ⅰ沒(méi)有明顯表達(dá)。免疫信號(hào)主要位于乳腺癌的細(xì)胞質(zhì)中。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)證實(shí)：CA Ⅰ廣泛表達(dá)于乳腺癌組織中，但在正常組織中不表達(dá)。

2.4 乳腺癌患者血液中的CA Ⅰ水平

CA Ⅰ在乳腺癌患者( 平均OD 值=0.91±0.46) 血液中的表達(dá)水平對(duì)比健康對(duì)照組(平均OD 值=0.55±0.55)顯著增加。其中14個(gè)乳腺癌血液樣本(15.22%)與健康對(duì)照組的平均水平相比呈雙倍或更高的表達(dá)水平。健康對(duì)照組中只有1個(gè)樣本(1.19%)的CA Ⅰ水平較平均值增高。乳腺癌血液樣本和健康對(duì)照組血清中CA Ⅰ水平明顯不同(P=9.18×10-5)。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：乳腺癌患者血液樣本中CA Ⅰ的表達(dá)水平顯著增加。

3 討論

乳腺癌微鈣化顆粒較細(xì),數(shù)目較多,密度較低,分布相對(duì)較廣[4,5]。不伴腫塊的鈣化，臨床病理證實(shí)多為原位癌或?qū)Ч軆?nèi)癌。長(zhǎng)管狀、線桿狀及分枝狀鈣化多為粉刺癌。散點(diǎn)狀、泥沙樣鈣化，鈣化直徑＜0.5mm，形態(tài)不規(guī)則，大小不等多為篩狀和微小乳頭狀導(dǎo)管原位癌。乳腺良性病變微鈣化顆粒較粗大、數(shù)目較少、密度較高、形態(tài)規(guī)則。研究發(fā)現(xiàn)：rs725605 位點(diǎn)突變與乳腺癌發(fā)生密切相關(guān)，CA Ⅰ基因表達(dá)升高與乳腺癌發(fā)生密切相關(guān)，升高的CA Ⅰ在乳腺癌腫瘤微鈣化中發(fā)揮重要作用[6-12]。

筆者認(rèn)為，CA Ⅰ在乳腺癌微鈣化中通過(guò)以下途徑發(fā)揮作用：乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中受到缺血缺氧、低血糖、免疫攻擊等因素影響，癌細(xì)胞周?chē)h(huán)境改變，觸發(fā)線粒體凋亡途徑、β 粒酶介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑等，導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡。癌細(xì)胞內(nèi)大量磷酸根和Ca2+進(jìn)入周?chē)h(huán)境，形成鈣鹽沉積微環(huán)境，促進(jìn)乳腺微鈣化形成。

因此CA Ⅰ在乳腺癌患者中高表達(dá)，并在乳腺癌患者乳腺微鈣化中發(fā)揮重要作用。