唐 杰，于永敏，馮 煦，常瑞霞

(鄭州市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000)

艾滋病(Acquired Immuno Deficiency Syndrome，AIDS)是臨床常見免疫缺陷性疾病，傳染性較強(qiáng)，傳播途徑廣泛，且近年來發(fā)病率逐漸上升，病死率較高，會嚴(yán)重威脅患者生命安全[1]。臨床應(yīng)采用安全可靠篩查方法進(jìn)行盡早確診治療。人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是其艾滋病傳染病毒，采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)對其抗體水平進(jìn)行檢測能確認(rèn)HIV感染情況，但臨床實(shí)際操作過程中，易受到多種影響因素影響，出現(xiàn)檢測結(jié)果錯誤，臨床應(yīng)針對性采取一定干預(yù)措施[2]。本研究選取我院AIDS患者98例，旨在分析ELISA法檢測HIV抗體結(jié)果錯誤相關(guān)影響因素，并對干預(yù)策略進(jìn)行探討?，F(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取我院AIDS患者98例(2019-08～2020-08)，其中男52例，女46例；年齡19～54歲，平均(35.28±7.56)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)HIV抗體篩查為AIDS；均經(jīng)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(WB)檢查確診為AIDS；均為感染門診、孕前檢查等；均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：精神或意識障礙；合并其他免疫系統(tǒng)疾?。缓喜盒阅[瘤、嚴(yán)重功能臟器障礙。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集與處理： 抽取AIDS患者3mL新鮮空腹靜脈血，并注意保證無菌，防止劇烈震蕩；于常溫下放置1～2h，血液凝固后進(jìn)行離心分離，速度為1500～3000r/min，時間為10～15min，于2～8℃下保存，5d內(nèi)進(jìn)行檢測。

1.2.2 ELISA法檢測： 選擇艾德康生物科技有限公司的Addcare Elisa1100型全自動酶免分析儀，英國Biochrom公司的安圖自動洗板機(jī)，北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司的人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒(國藥準(zhǔn)字S20080008)，上海一恒科技儀器有限公司的DK-600A型恒溫水箱，大龍醫(yī)療設(shè)備(上海)有限公司的Finnpipette可調(diào)移液器。將樣品采用緩沖液進(jìn)行稀釋，每孔加100μL，設(shè)置2排陰性對照孔及平行孔，于4℃下包被12～18h；然后于37℃采用封閉液進(jìn)行封閉1h，采用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗滌3次，2min/次，加入100μL稀釋后的一抗，于37℃下保溫孵育30min，再用PBST洗滌2min；加入100μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，于37℃下保溫孵育15min，洗滌后加入50μL顯色A液、B液，5min后加入終止液50μL，最終采用450nm波長測量各孔吸光度(OD)值，計(jì)算HIV抗體濃度。HIV抗體陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：樣本OD值/陽性判斷值(S/C.O)≥1為陽性，<1為陰性。

1.2.3 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)： (1)樣品的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，加樣并在同一塊膠上按順序做重復(fù)點(diǎn)樣，用于免疫鑒定及蛋白染色顯帶。(2)轉(zhuǎn)移印跡，a轉(zhuǎn)移前將濾紙、硝酸纖維素膜剪成與膠一樣大小，浸入蒸餾水中10～20min轉(zhuǎn)移至buffer中并平衡30min；b凝膠平衡，將電泳后膠板置于buffer中并平衡30～60min；c逐層鋪開，保證各層之間無皺褶、氣泡；d開始轉(zhuǎn)移，連接正負(fù)極，蓋上蓋子并連接電源，以恒流0.8mA/cm室溫下轉(zhuǎn)移1h，轉(zhuǎn)移后凝膠再用氨基黑染色液進(jìn)行20min染色，脫色后檢測效果。(3)免疫染色，a轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜置于5%脫脂奶粉中封閉，于4℃下過夜；b采用三乙醇胺緩沖鹽水溶液洗膜1～2次，10min/次；c加入辣根過氧化物標(biāo)記的抗體，室溫下放置1h；d三乙醇胺緩沖鹽水溶液沖洗3次，10min/次；e硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)入過氧化物酶顯色液中，置于暗處進(jìn)行反應(yīng)，達(dá)到最佳程度時，采用三蒸水洗滌后終止反應(yīng)。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)ELISA法檢測HIV抗體的結(jié)果。(2)ELISA法檢測HIV抗體結(jié)果錯誤相關(guān)影響因素。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，行χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA法檢測HIV抗體的結(jié)果

98例AIDS患者經(jīng)ELISA法檢測結(jié)果中HIV抗體陽性92例，陰性6例；ELISA法診斷符合率為93.88%(92/98)。

2.2 ELISA法檢測HIV抗體結(jié)果錯誤相關(guān)影響因素

經(jīng)調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，ELISA法檢測HIV抗體結(jié)果錯誤相關(guān)影響因素包括標(biāo)本干擾因素、試劑選取及處理、儀器調(diào)試及操作、溫度控制、技術(shù)人員因素等多種因素。漏診患者中1例原因?yàn)闃?biāo)本中含有補(bǔ)體，1例為標(biāo)本溶血，1例為標(biāo)本污染，1例為標(biāo)本處理不當(dāng)，1例為試劑選取不當(dāng)，1例為溫度控制不佳。

3 討論

AIDS患者HIV病毒主要攻擊人類免疫系統(tǒng)，多伴有發(fā)熱咳嗽、腹瀉便血、精神智力障礙、偏癱等精神異常，臨床應(yīng)給予早期診斷治療，挽救患者生命，延長生存期限[3]。

HIV抗體檢測是臨床常用檢測確診手段，本研究98例AIDS患者經(jīng)ELISA法檢測結(jié)果中HIV抗體陽性92例，陰性6例；ELISA法診斷符合率為93.88%。ELISA屬于固相免疫檢測方法，具有便捷簡單、特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢，且能多次重復(fù)操作，但操作過程中會出現(xiàn)HIV抗體結(jié)果錯誤，影響診斷效果[4]。且鄒竹芳[5]學(xué)者研究表明，ELISA法檢測HIV抗體過程中，血液標(biāo)本保存是影響檢測結(jié)果的最重要因素。本研究中出現(xiàn)6例漏診，其中1例漏診是由于標(biāo)本中含有補(bǔ)體，1例為標(biāo)本溶血，1例為標(biāo)本污染，1例為標(biāo)本處理不當(dāng)，1例為試劑選取不當(dāng)，1例為溫度控制不佳，與付晶鑫[8]學(xué)者研究中ELISA法檢測HIV抗體涉及試劑、標(biāo)本、人員操作、溫度等多種因素具有一致性。標(biāo)本因素是HIV抗體結(jié)果錯誤的最重要影響因素，標(biāo)本采集過程中極易受到高濃度非特異性免疫球蛋白、補(bǔ)體、類風(fēng)濕因子，會導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)誤診；且標(biāo)本采集、送檢、保存過程中會由于操作不當(dāng)導(dǎo)致溶血、污染，且標(biāo)本儲存時間過長，凝集不全[6]。ELISA試劑可能已經(jīng)超過有效使用期，且不同廠家及批號試劑中酶標(biāo)記物濃度不一定相同，或者運(yùn)輸儲存條件不達(dá)標(biāo)，導(dǎo)致敏感性、特異性降低，導(dǎo)致酶試劑失活[7]。檢測儀器由于長時間缺乏維護(hù)，灰塵遮擋光學(xué)系統(tǒng)影響波長變化；洗板機(jī)使用后沖洗不及時，發(fā)生堵塞影響檢測效果，且在加樣過程中移液槍使用過程中會出現(xiàn)偏差；或者出現(xiàn)正常運(yùn)行但檢測結(jié)果易出現(xiàn)偏差，影響HIV抗體檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。溫度是影響ELISA法檢測過程中的重要因素，酶類物質(zhì)反應(yīng)在很大程度上受到溫度影響，溫度過高或過低均會影響酶反應(yīng)活性，進(jìn)而影響檢測準(zhǔn)確性[9]。

據(jù)此，臨床應(yīng)采取相應(yīng)干預(yù)措施：(1)標(biāo)本采集后可將0.01mol/L濃度、pH為7.2的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋，并在56℃下滅活30min；(2)標(biāo)本采集過程中應(yīng)嚴(yán)格遵循無菌操作，并避免劇烈震蕩引起溶血，并在采集后于常溫下放置1h，血液凝固后進(jìn)行離心，加入抗凝物質(zhì)時盡可能不用酶抑制劑，避免對ELISA試劑中酶活性的影響；(3)試劑使用之前查看使用期限，并避免不同廠家或批號的酶試劑混用，儲存條件應(yīng)在2～8℃，不可反復(fù)受熱及凍融，使用前進(jìn)行預(yù)處理，保持與室溫相似，避免影響抗原抗體結(jié)合反應(yīng)速度，引起結(jié)果差異；(4)應(yīng)對儀器進(jìn)行定期清理，酶標(biāo)儀在使用前開機(jī)預(yù)熱30min，洗板機(jī)在使用后及時沖洗管路5～6次，加樣時先搖晃滴瓶，預(yù)吸后擠去第一滴后進(jìn)行滴加，避免產(chǎn)生氣泡，并加到酶標(biāo)板底部，避免污染樣本。(5)采用恒溫箱控制溫度，并在恒溫箱內(nèi)放置溫度計(jì)，并等溫度平衡后使用，未用完的實(shí)驗(yàn)試劑保存于有干燥劑的密封袋中并放入冰箱中保存。

綜上所述，ELISA法檢測AIDS患者HIV抗體結(jié)果錯誤相關(guān)影響因素與標(biāo)本、試劑、儀器、操作等多個環(huán)節(jié)均密切相關(guān)，臨床應(yīng)據(jù)此制定針對性干預(yù)策略，進(jìn)一步提高檢測準(zhǔn)確性，為AIDS的排查篩除提供一定科學(xué)依據(jù)。