凌徐心儀，張 瑤，鐘 華

上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200030

肺癌是當(dāng)今全球最常見的癌癥，肺癌患者占癌癥患者總?cè)藬?shù)的11.6%，占癌癥致死總?cè)藬?shù)的18.4%［1］。在我國，肺癌的發(fā)病率和死亡率在所有癌癥中居于首位［2］。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的絕大多數(shù)，預(yù)后較差；超過半數(shù)患者就診時已處于晚期，錯過了手術(shù)時機，而傳統(tǒng)的放化療效果并不理想。肺癌的靶向治療可用于部分具有特征性基因突變的患者。近年來，免疫治療逐步走入大眾視野，免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）的作用機制是通過阻斷免疫反應(yīng)的抑制途徑，恢復(fù)并維持免疫系統(tǒng)對癌細(xì)胞的攻擊。美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）和歐洲藥品管理局（European Medicine Agency，EMA）已批準(zhǔn)在NSCLC中使用抗程序性死亡蛋白-1/程序性死亡蛋白配體-1（programmed death-1/programmed death-ligand 1，PD-1/PD-L1）單藥治療。帕博利珠單抗（pembrolizumab）可用于一線或二線治療，納武單抗（nivolumab）和阿替利珠單抗（atezolizumab）可用于二線治療。ICIs能給部分NSCLC患者帶來長期的生存獲益，但是受益人群僅占少數(shù)。大部分患者可能承擔(dān)了昂貴的治療費用卻未產(chǎn)生明顯應(yīng)答，并且可能要承受免疫治療的多種不良反應(yīng)，甚至有一小部分患者會面臨腫瘤超進展的風(fēng)險。因此，在應(yīng)用ICIs之前精準(zhǔn)篩選獲益人群很有必要。由于NSCLC相關(guān)免疫反應(yīng)的復(fù)雜性，有很多環(huán)節(jié)都可能會影響NSCLC患者對ICIs的應(yīng)答，如腫瘤細(xì)胞表面分子與相關(guān)配體、腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞與分子水平、驅(qū)動基因突變等。因此，明確這些環(huán)節(jié)與ICIs最終療效的關(guān)系，尋找合適的生物標(biāo)志物來篩選對ICIs高應(yīng)答的患者，方能給患者最大的益處。本文基于最新的研究報道，圍繞NSCLC患者對免疫治療應(yīng)答水平的預(yù)測指標(biāo)研究進展做一綜述。

1 免疫治療在NSCLC中的應(yīng)用現(xiàn)狀

近年來，ICIs成為晚期NSCLC的治療新選擇。2017年，ICIs獲FDA批準(zhǔn)成為特定類型NSCLC的一線治療方案。2017年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南中NSCLC專家組建議，PD-L1表達水平≥50%，且表皮生長因子受體基因（epidermal growth factor receptor，EGFR）、間變性淋巴瘤激酶基因（anaplastic lymphoma kinase，ALK）、C-Ros癌基因1（C-Ros oncogene 1，ROS1）和B-Raf原癌基因（B-Raf proto-oncogene，BRAF）陰性或未知的晚期NSCLC患者可應(yīng)用帕博利珠單抗作為一線治療［3-4］。

目前，帕博利珠單抗、納武單抗、阿替利珠單抗單藥可用于后線治療，帕博利珠單抗（或阿替利珠單抗）聯(lián)合化療可用于一線治療，度伐利尤單抗（durvalumab）可作為放化療后鞏固治療。這些均已成為針對部分類型NSCLC患者的推薦治療方案［4］。目前臨床上主要依據(jù)患者腫瘤的病理類型、臨床分期，以及某些重要的生物標(biāo)志物，如PD-L1表達水平以及驅(qū)動基因突變結(jié)果，來篩選出可能受益人群，并制定合理的免疫治療方案。

2 預(yù)測NSCLC療效的生物標(biāo)志物

2.1 PD-L1

在ICIs藥物研發(fā)的早期階段，就有研究人員嘗試把NSCLC患者腫瘤細(xì)胞的PD-L1表達水平作為預(yù)測療效的生物標(biāo)志物。一篇系統(tǒng)綜述［5］集合了19項評估患者腫瘤PD-L1表達對ICIs治療晚期NSCLC效果影響的研究，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)證據(jù)表明，相較于PD-L1低表達的患者，高表達的患者接受抗PD-1/PD-L1藥物［納武單抗、帕博利珠單抗、度伐利尤單抗、阿替利珠單抗和阿維魯單抗（avelumab）］單藥治療時獲益更大。PD-L1表達水平在預(yù)測ICIs療效方面的應(yīng)用相對成熟，目前已成為臨床醫(yī)師制定NSCLC患者免疫治療方案的重要依據(jù)。

然而，也有研究表明腫瘤細(xì)胞PD-L1表達水平與NSCLC患者對ICIs的應(yīng)答并不存在相關(guān)性。OAK臨床試驗觀察到，對于接受鉑類藥物治療后疾病進展的晚期NSCLC患者，無論PD-L1表達水平如何，阿替利珠單抗帶來的總生存時間（overall survival，OS）獲益均高于多西他賽［6］。PACIFIC臨床試驗發(fā)現(xiàn)，對于不可切除的Ⅲ期NSCLC且放化療后無進展的患者，無論其PD-L1表達水平如何，接受度伐利尤單抗鞏固治療均有無進展生存時間（progression-free survival，PFS）獲益，PD-L1表達水平≥1%的所有患者均有OS獲益［7］。CheckMate017試驗表明，無論晚期鱗癌患者的PD-L1的表達水平如何，接受后線納武單抗后OS、PFS、緩解率（response rate，RR）均明顯高于多西他賽［8］。而CheckMate057試驗卻發(fā)現(xiàn)對于非鱗NSCLC，療效的改善均與PD-L1表達水平相關(guān)［9］。此類研究證實了PD-L1表達水平用于預(yù)測ICIs療效的局限性，即可能受腫瘤組織學(xué)類型等方面的影響；通過與其他已有的，或潛在的生物標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用可能改善其局限性。

2.2 腫瘤微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）是指腫瘤細(xì)胞周圍存在的微環(huán)境，包括血管、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓源性炎性細(xì)胞、各種信號分子，以及細(xì)胞外基質(zhì)。TME所具有的免疫抑制特性可以阻礙ICIs發(fā)揮療效。研究表明TME中各種免疫細(xì)胞、表面分子以及某些化學(xué)分子水平均呈現(xiàn)出預(yù)測ICIs療效的潛力。

2.2.1 TME中PD-L1的表達 PD-L1不僅在腫瘤細(xì)胞表面表達，在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）表面也有一定的表達。因腫瘤細(xì)胞PD-L1水平還不足以準(zhǔn)確預(yù)測ICIs療效，研究人員推斷TIL中PD-L1的表達可作為輔助指標(biāo)，但現(xiàn)有研究仍存在爭議。Mazzaschi等［10］的研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞分化抗原8（cluster of differentiation 8，CD8）CD8+TIL的PD-1表達與晚期NSCLC患者對納武單抗治療的應(yīng)答水平正相關(guān)；Thommen等［11］卻發(fā)現(xiàn)CD8+TIL的PD-1表達與Ⅳ期NSCLC患者OS和持久的藥物反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)。因此TME中PD-L1的表達是否能夠預(yù)測NSCLC患者對ICIs的應(yīng)答水平有待進一步研究明確。

2.2.2 TME中的免疫細(xì)胞亞群 研究人員在分析TME對晚期NSCLC患者同步放化療效果的影響時，依據(jù)腫瘤內(nèi)PD-1/PD-L1表達水平和CD8+TIL水平定義了4種腫瘤免疫微環(huán)境類型（tumor immune microenvironment type，TIMT），而特定的TIMT分型可能對于晚期NSCLC的治療具有一定的指導(dǎo)作用［12-13］。Lin等［14］發(fā)現(xiàn)在晚期NSCLC患者中，不同TIMT分型與免疫治療的OS高度相關(guān)。此外，Mazzaschi等［15］將晚期NSCLC患者血液循環(huán)中自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞的水平與血液/組織CD8+淋巴細(xì)胞中PD-1表達水平相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)這種聯(lián)合模式可以預(yù)測抗PD-1治療的效果。Cho等［16］發(fā)現(xiàn)，外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中晚期NK細(xì)胞群的百分比在良好應(yīng)答組中顯著高于無應(yīng)答組。這些結(jié)果表明了NK細(xì)胞的總體活性或數(shù)量可能是預(yù)測免疫治療反應(yīng)的有效生物標(biāo)志物。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）同樣可能與免疫治療反應(yīng)相關(guān)，其主要機制是Treg細(xì)胞優(yōu)先結(jié)合共刺激分子，從而誘導(dǎo)其在抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）表面的下調(diào)，抑制效應(yīng)T細(xì)胞的激活［17］。研究［18-19］報道，Treg上調(diào)了包括NSCLC在內(nèi)多種腫瘤的免疫檢查點分子的表達，提示ICIs的療效可能受到患者TME中Treg水平的影響。TME中PD-L1+CD4+CD25+Treg的密度也可能是一個有意義的指標(biāo)，呈現(xiàn)出預(yù)測NSCLC患者對PD-1/PD-L1抑制劑應(yīng)答水平的能力［20］。另外，骨髓來源的抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）被證實在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和前列腺癌中與患者對ICIs的應(yīng)答程度顯著相關(guān)［21］，有待今后的研究去探索其在NSCLC領(lǐng)域的應(yīng)用價值。

2.2.3 吲哚胺2，3-二加氧酶 吲哚胺2，3-二加氧酶（indoleamine2，3-dioxygenase，IDO）參與色氨酸（tryptophan，trp）代謝，是犬尿氨酸（kynurenine，kyn）生成步驟中的限速酶之一。IDO是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有免疫抑制功能。它在腫瘤發(fā)展過程中被激活，有助于惡性細(xì)胞逃脫免疫系統(tǒng)的殺傷，可以在NSCLC等多種癌癥中過表達［22-24］。Botticelli等［25］將kyn/trp比值及喹啉酸濃度作為IDO活性的指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)接受二線納武單抗治療前IDO活性較高的NSCLC患者更易發(fā)生早期進展，表明IDO活性與NSCLC患者對ICIs的反應(yīng)相關(guān)。

2.3 腫瘤細(xì)胞中的基因改變

2.3.1 腫瘤突變負(fù)荷 腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden，TMB）是指在一個特定的腫瘤組織中相對的基因突變數(shù)量；如果腫瘤中存在更多的非同義突變，則有更多的新抗原出現(xiàn)，PD-1—PD-L1軸參與阻斷的免疫反應(yīng)就會相應(yīng)增多，進而影響腫瘤細(xì)胞對ICIs的應(yīng)答。多年前就有研究人員發(fā)現(xiàn)在NSCLC中，較高的TMB與使用帕博利珠單抗治療的PFS相關(guān)［26］。此后，Checkmate-227臨床試驗結(jié)果表明，無論高TMB（≥10個突變/Mb）的NSCLC患者PDL1表達狀態(tài)如何，納武單抗和伊匹木單抗（ipilimumab）聯(lián)用作為一線治療都顯著延長了患者的PFS［27］?；谶@一研究結(jié)果，NCCN-NSCLC專家組于2019第1版NCCN指南中將TMB列為生物標(biāo)志物，認(rèn)為有助于篩選適合納武單抗±伊匹木單抗一線治療的轉(zhuǎn)移性NSCLC患者，但同時聲明了目前尚無標(biāo)準(zhǔn)的TMB測量方法［4］。Wu等［28］對總計納入4 431名患者的29項研究進行了meta分析，證明TMB對于黑色素瘤及NSCLC的ICIs療效具有預(yù)測作用，結(jié)合TMB和PD-L1表達建立分型模型同樣是一種有效的預(yù)測方式。研究結(jié)果提出以下局限性：多數(shù)研究在西方人群中進行，今后需要更多納入亞洲人群的平行研究；基于不同二代測序檢測范圍的TMB檢測結(jié)果存在明顯的異質(zhì)性，可能會影響預(yù)測的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，這些影響因素需要在未來的研究中實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。綜上，TMB作為療效預(yù)測生物標(biāo)志物的價值已比較明確，但其應(yīng)用方式尚無定論，仍需完善合理的檢測方式、統(tǒng)一分型標(biāo)準(zhǔn)。

TMB作為生物標(biāo)志物的潛力不僅局限于基因?qū)用?，還可拓展到蛋白水平。TMB可能導(dǎo)致腫瘤新抗原的產(chǎn)生（過渡）。野生型抗原在體細(xì)胞突變情況下產(chǎn)生新抗原，而T細(xì)胞識別新抗原對于PD-1抑制劑的效應(yīng)很重要。McGranahan等［29］的研究表明腫瘤中新抗原的數(shù)量與TMB相關(guān)，且新抗原負(fù)荷高的NSCLC患者接受帕博利珠單抗治療獲益明顯高于新抗原負(fù)荷低的患者。因此，腫瘤相關(guān)新抗原的水平可能是預(yù)測NSCLC患者對ICIs反應(yīng)的一個研究方向。

2.3.2 驅(qū)動基因 目前已知多種驅(qū)動基因陽性的NSCLC患者對免疫治療的應(yīng)答很低，部分驅(qū)動基因突變已是ICIs臨床應(yīng)用的關(guān)鍵排除標(biāo)準(zhǔn)。攜帶EGFR突變或ALK重排與NSCLC患者對ICIs的低應(yīng)答顯著相關(guān)［30-32］。2020年NCCN指南中NSCLC專家組提出，PD-1表達水平≥1%但具有驅(qū)動基因突變的NSCLC患者應(yīng)首先選用靶向治療，而非ICIs。在使用PD-1或PD-L1抑制劑之前，至少需檢測EGFR和ALK狀態(tài)，若能補充檢測“ROS1融合”和“BRAF突變”為陰性則更加理想［4］。指南未明確指出的其他突變基因也可能與ICIs應(yīng)答水平相關(guān)。Kim等［33］進行了meta分析，調(diào)查Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）突變狀態(tài)是否影響晚期NSCLC患者的ICIs生存獲益，發(fā)現(xiàn)與多西他賽化療相比，二線ICIs延長了KRAS突變型NSCLC患者的OS，KRAS野生型NSCLC的患者的OS卻無顯著改善。KRAS突變往往伴隨絲氨酸蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase 11，STK11）突變；最近的一項研究不僅證實了STK11/KRAS的關(guān)聯(lián)，還表明STK11/肝臟激酶B1（liver kinase B1，LKB1）突變與KRAS突變患者對納武單抗的不良應(yīng)答有關(guān)［34］。一些非常見腫瘤基因的突變同樣可能預(yù)測NSCLC患者對ICIs的應(yīng)答水平。在NSCLC患者中，磷脂酰肌醇-4，5-雙磷酸3-激酶催化亞基α（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA）、EGFR或STK11突變者對ICIs無反應(yīng)，而KRAS、腫瘤蛋白P53（tumor protein P53，TP53）突變型或間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子（mesenchymal to epithelial transition factor，MET）基因14號外顯子跳躍突變者對ICIs反應(yīng)良好［35］。未來仍需更多研究挖掘眾多腫瘤驅(qū)動基因中可用于預(yù)測ICIs療效的潛在生物標(biāo)志物。

2.3.3 T細(xì)胞炎性基因 T細(xì)胞炎性基因涵蓋了一系列與腫瘤免疫反應(yīng)相關(guān)的基因，這些基因的表達產(chǎn)物與腫瘤發(fā)生發(fā)展及對ICIs的應(yīng)答水平息息相關(guān)。Higgs等［36］發(fā)現(xiàn)在接受ICIs治療的NSCLC患者中，四基因干擾素γ（interferon-γ，IFNγ）高信號患者相較于低信號患者，客觀緩解率（objective response rate，ORR）、中位PFS和OS顯著提高，且這一趨勢與PD-L1表達水平無關(guān)。所采用的四基因包含IFNγ、CD274、淋巴細(xì)胞激活基因-3（lymphocytes activate gene，LAG3）、趨化因子配體9（chemokine ligand 9，CXCL9）。Ayers等［37］報告了一種18基因T細(xì)胞炎性基因表達譜（gene expression profiles，GEP）在NSCLC等多種實體瘤中均可用于預(yù)測帕博利珠單抗的療效。Danaher等［38］也將18個T細(xì)胞炎性基因納入考慮，包括抗原提呈相關(guān)（PSMB10、HLA-DQA1、HLA-DRB1、CMKLR1）、趨化因子表達相關(guān)（CCL5、CSCL9、CD27、CXCR6、IDO1、STAT1）、T細(xì)胞/NK細(xì)胞豐度相關(guān)（HLAE、NKG7、CD8A）、T細(xì)胞衰竭相關(guān)（TIGIT、LAG3、CD274、PDCD1LG2、CD276）的4大類基因，將它們的表達水平標(biāo)準(zhǔn)化后加權(quán)線性組合，建立腫瘤炎癥特征（tumor inflammation signature，TIS）評分標(biāo)準(zhǔn)。將TIS算法應(yīng)用于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫公開的9 000多種腫瘤基因表達譜，發(fā)現(xiàn)對PD-1抑制劑敏感的腫瘤具有更高的TIS評分，可見T細(xì)胞炎性基因的檢測在篩選NSCLC獲益人群方面的潛力。

2.3.4 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性/錯配修復(fù)受損 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）是由DNA錯配修復(fù)受損（mismatch repair deficiency，MMRd）導(dǎo)致的遺傳超變異性。MMR可以糾正DNA復(fù)制過程中自然發(fā)生的錯誤，例如單堿基錯配或短插入和缺失。MMR功能異常的細(xì)胞無法糾正DNA復(fù)制過程中發(fā)生的錯誤，從而導(dǎo)致了新型微衛(wèi)星碎片的產(chǎn)生。MSI的存在提示MMR不能正常運作，其高低與修復(fù)DNA錯誤的能力成反比，因此MSI可作為代替MMRd水平的評估指標(biāo)［39］?；谝幌盗刑骄扛鞣N腫瘤MMRd和帕博利珠單抗療效之間關(guān)系的Keynote試驗，2017年FDA批準(zhǔn)：若具有MMRd的惡性實體瘤在接受治療后仍進展，且沒有其他合適的治療選擇，可使用帕博利珠單抗。此外，已有多項研究［40-41］證明，在部分實體瘤尤其是結(jié)直腸癌中，MSI與患者對ICIs的響應(yīng)密切相關(guān)。在肺癌領(lǐng)域，目前MSI/MMRd對于ICIs療效的預(yù)測價值仍然未知。

3 ICIs治療NSCLC效果的復(fù)合預(yù)測模型

對于PD-L1表達水平與TMB這2種目前比較成熟的生物標(biāo)志物，若將其中之一作為獨立因素進行對NSCLC患者的療效預(yù)測，可靠性往往不足。研究人員因此嘗試聯(lián)合雙重或多重生物標(biāo)志物建立預(yù)測模型，結(jié)果表明NSCLC患者的TMB與PD-L1表達水平之間并無相關(guān)性，但其作為雙重變量可以提高對ICIs療效的預(yù)測能力［42］。最具熱度的模型是運用PD-1/PD-L1表達水平結(jié)合CD8+TIL水平定義4種TIMTs，但基于這一模型的研究得到了不完全一致的結(jié)果［10-14］。Lee等［43］提出了一個三變量模型，納入了患有NSCLC等21種癌癥的7 187名患者，分析了36種生物標(biāo)志物與ICIs療效的相關(guān)性，它們分別與腫瘤新抗原、腫瘤免疫微環(huán)境和檢查點相關(guān)；根據(jù)這一規(guī)律將這些生物標(biāo)志物劃分為3大類型，對各類型中相關(guān)性最強的生物標(biāo)志物提出雙變量和三變量的復(fù)合模型猜想，發(fā)現(xiàn)TMB與CD8+T細(xì)胞豐度（estimated CD8+Tcell abundance，eCD8T）組合的模型預(yù)測準(zhǔn)確性顯著高于任一單變量，再加入高PD-1mRNA表達樣品的比例（fraction of high PD-1 messenger RNA expression samples，fPD1）構(gòu)建三變量模型后，其與患者對ICIs的反應(yīng)顯示出更高的相關(guān)性（Spearman，R=0.90）。明顯偏離三變量模型預(yù)測結(jié)果的瘤種僅為多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和微衛(wèi)星穩(wěn)定型結(jié)腸癌。NSCLC患者對ICIs的應(yīng)答與三變量模型高度相關(guān)，表明這一模型應(yīng)用于NSCLC的ICIs療效預(yù)測很有前景。此外，還有學(xué)者提出聯(lián)用多重生物標(biāo)志物建立評估流程以實現(xiàn)個性化免疫療法的設(shè)想，列出一系列與癌癥免疫相關(guān)的特征，包括輔助性T細(xì)胞1（helper Tcell，Th1）功能、PD-L1表達、腫瘤外圍T細(xì)胞、主要組織相容性復(fù)合體-1（major histocompatibility complex-1，MHC-1）表達以及其他免疫抑制因子和細(xì)胞，依據(jù)這些指標(biāo)為患者逐步制訂個體化的免疫治療方案［44］。具有不同免疫特征的患者可能受益于不同的治療策略，這種篩選流程使得癌癥的精準(zhǔn)免疫治療更進一步。

4 結(jié)語

免疫治療可改善NSCLC的預(yù)后，但目前尚無理想的方案來篩選獲益人群，因此尋找合適的生物標(biāo)志物顯得尤為重要。目前腫瘤細(xì)胞的PD-L1表達水平以及TMB是2個已應(yīng)用于臨床的生物標(biāo)志物，但均存在應(yīng)用范圍局限、測量方式未標(biāo)準(zhǔn)化的問題，可靠性也有待明確。近年的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種分子或基因具有成為生物標(biāo)志物的潛力。在蛋白水平，TME中PD-L1、各免疫細(xì)胞亞群（CD8+TIL、NK、Treg等）數(shù)量和IDO的表達均與NSCLC接受ICIs治療的良好應(yīng)答相關(guān)。基因?qū)用嫱瑯又档锰剿?，腫瘤的部分驅(qū)動基因突變水平和MSI水平不同程度地呈現(xiàn)出預(yù)測NSCLC患者ICIs應(yīng)答水平的能力。此外，這些生物標(biāo)志物在聯(lián)合應(yīng)用時的療效預(yù)測能力表現(xiàn)良好。因此，聯(lián)合應(yīng)用不同的生物標(biāo)志物，建立雙變量或多變量模型是將來ICIs療效預(yù)測的發(fā)展方向。

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