中樞nesfatin-1表達下調(diào)對SD大鼠胰島素信號通路的影響

瞿文娟曾夢1李志勇程昌琴楊若梅蔣先淑楊剛毅1李伶2

(重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶402160)

摘要〔〕目的探討中樞nesfatin-1表達下調(diào)對SD大鼠肝胰島素信號通路的影響。方法將雄性SD大鼠隨機分為普食喂養(yǎng)+人工腦脊液(aCSF)輸注組(NCA組，n=10)，普食喂養(yǎng)+ Ad-shGFP輸注組(NCG 組，n=10)，普食喂養(yǎng)+ Ad-shNUCB2輸注組(NCN組，n=10)，高脂喂養(yǎng)+人工腦脊液(aCSF)輸注組(HFA組，n=10)，高脂喂養(yǎng)+Ad-shGFP輸注組(HFG組，n=10)，高脂喂養(yǎng)+ Ad-shNUCB2 輸注組(HFN組，n=10)。構(gòu)建第三腦室微量輸注系統(tǒng)進行第三腦室干預，留取普食組大鼠下丘腦、肝臟、脂肪和肌肉組織采用Western印跡測定 nesfatin-1表達。采用Western印跡法測定各組大鼠G6Pase及PEPCK的表達水平以和IR、IRS-1、AKT、STAT3及mTOR的蛋白磷酸化水平變化。結(jié)果和NCA或NCG組分別相比，NCN組下丘腦nesfatin-1表達顯著降低(P<0.05)，而外周組織(肝、脂肪及肌肉)nesfatin-1表達無顯著差異。和NCA組相比，HFA組的G6Pase、PEPCK表達水平均顯著增高，而 IR、IRS-1、AKT、STAT3、mTOR的蛋白磷酸化水平均顯著降低(P<0.05)。和NCA或NCG 組相比，NCN組的G6Pase、PEPCK表達水平均顯著增高，而IR、IRS-1、AKT、 STAT3、mTOR的蛋白磷酸化水平均顯著降低(P<0.05)。和HFA或HFG 組相比，HFN組的G6Pase、PEPCK表達水平均顯著增高，而IR、IRS-1、AKT、STAT3、mTOR的蛋白磷酸化水平均顯著降低(P<0.05)。結(jié)論中樞Ad-shNUCB2輸注可下調(diào)SD大鼠下丘腦 nesfatin-1表達，同時下調(diào)機體肝胰島素信號通路級聯(lián)反應蛋白水平，可能通過抑制mTOR/STAT3信號通路從而降低機體肝臟糖異生。

關鍵詞〔〕Nesfatin-1；腦室內(nèi)輸注；胰島素信號通路；肝糖異生

中圖分類號〔〕R589.1〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學

通訊作者：李志勇(1968-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事胰島素抵抗、糖脂代謝研究。

1重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科

2重慶醫(yī)科大學檢驗系臨床生化教研室和教育部實驗診斷重點實驗室

第一作者：瞿文娟(1982-)，女，在讀碩士，醫(yī)師，主要從事糖尿病方面的研究。

Effects of central nesfatin-1 knockdown on hepatic insulin signaling pathway

QU Wen-Juan, ZENG Meng, LI Zhi-Yong，etal.

Department of Endocrinology, Yongchuan Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 402160, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of central nesfatin-1 knockdown on hepatic insulin signaling pathway.MethodsMale Sprague-Dawley(SD) rats were randomly divided into normal-chow die (NCD) + aCSF (NCA, n=10), NCD + Ad-shGFP(NCG, n=10), NCD + Ad-shNUCB2 (NCN, n=10), high-fat diet (HFD) + aCSF(HFA, n=10), HFD + Ad-shGFP(HFG, n=10), HFD + Ad-shNUCB2 groups (HFN, n=10). After central intervention, NCD-fed rats were sacrificed and the expressions of nesfatin-1 in hypothalamic and peripheral tissues were examined. Other rats were sacrificed and the tissues were quickly taken away. The phosphorylated protein levels of IR, IRS-1, AKT, STAT3 and mTOR, and the protein levels of G6Pase, PEPCK were evaluated by Western blot.ResultsAfter central Ad-shNUCB2 intervention, hypothalamic nesfatin-1 protein levels was significantly decreased by 66% compared with rats that were given ACF or Ad-shGFP(P<0.05). However, no significant differences were found in nesfatin-1 expression in liver, muscle and adipose tissues. Compared with those of NCA group, the protein levels of G6Pase and PEPCK in HFA group were increased significantly (P<0.05). However, the phosphorylated protein levels of IR, IRS-1, AKT, STAT3 and mTOR inHFA group were decreased obviously(P<0.05). Compared with those of NCA or NCG groups, the protein levels of G6Pase and PEPCK in NCN group were increased significantly (P<0.05). However, the phosphorylated protein levels of IR, IRS-1, AKT, STAT3 and mTOR in NCN group were markedly decreased (P<0.05). Compared with HFA or HFG groups, the levels of G6Pase and PEPCK in HFN group were increased significantly (P<0.05). However, the phosphorylated protein levels of IR, IRS-1, AKT, STAT3 and mTOR in HFN group were decreased significantly (P<0.05).ConclusionsCentral Ad-shNUCB2 intervention could decrease hypothalamic nesfatin-1 protein levels significantly. Knockdown of central nesfatin-1 could decrease the phosphorylation of several proteins in insulin signaling cascade. Moreover, central nesfatin-1 knockdown could lighten insulin sensitivity through inhibition of mTOR-STAT3 signaling pathway.

【Key words】Nesfatin-1；Intracerebroventricular infusion；Insulin signaling pathway；Hepatic gluconeogenesis

Nesfatin-1是一種新發(fā)現(xiàn)的下丘腦抑制攝食因子〔1〕，廣泛表達于下丘腦各核團，在機體其他組織如胰腺組織、腦垂體、睪丸中均有表達〔2〕。越來越多的研究顯示，nesfatin-1不但在能量代謝方面起到重要的作用，其與胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生發(fā)展也有著密切的關系〔3〕。然而，中樞nesfatin-1 調(diào)節(jié)胰島素信號及糖代謝的具體作用機制目前尚不完全清楚。因此，本研究采用RNAi技術構(gòu)建的nesfatin-1小干擾分子表達腺病毒Ad-shNUCB2，探索中樞nesfatin-1表達下調(diào)對胰島素信號通路、肝臟糖異生關鍵基因的調(diào)控及可能的分子作用機制。

1材料和方法

1.1材料及試劑大鼠源性nesfatin-1干擾重組腺病毒載體Ad-shNUCB2由本課題組前期構(gòu)建；重組綠色熒光蛋白腺病毒載體(Ad-shGFP)為空載對照病毒，由重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院提供；人工腦脊液(aCSF)由BioPanda公司提供；組織蛋白提取試劑RIPA、PMSF及BCA蛋白測定試劑購自碧云天公司；兔抗小鼠葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)一抗、兔抗小鼠磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)一抗均購自美國Santa Cruz公司，兔抗小鼠nesfatin-1一抗購自英國ABCAM公司，兔源p-IR、IR、p-IRS-1、IRS-1、p-AKT、AKT、p-STAT3、STAT3、p-mTOR及mTOR一抗均購自美國Cell Signaling公司；兔抗小鼠β-actin一抗、HRP標記的羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋公司。

1.2方法

1.2.1動物模型健康雄性四周齡SD大鼠60只，體重約100～120 g，適應性喂養(yǎng)1 w后，隨機分為普食喂養(yǎng)+人工腦脊液(aCSF)輸注組(NCA組)，普食喂養(yǎng)+Ad-shGFP輸注組(NCG組)，普食喂養(yǎng)+Ad-shNUCB2輸注組(NCN組)，高脂喂養(yǎng)+人工腦脊液(aCSF)輸注組(HFA組)，高脂喂養(yǎng)+Ad-shGFP輸注組(HFG組)，高脂喂養(yǎng)+Ad-shNUCB2輸注組(HFN組)，每組10只。各組大鼠均喂養(yǎng)10 w，普通飼料(熱卡百分比：脂肪7.39%，蛋白質(zhì)18.81%，碳水化合物51.96%，其他21.94%)和高脂飼料(熱卡百分比：脂肪26.8%，蛋白質(zhì)14.83%，碳水化合物40.97%，其他17.5%)均由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院的野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供。大鼠禁食5 h后，測量其體重并用氯胺酮腹腔麻醉(87 mg/kg)，備皮后，取俯臥位，頭部固定于大鼠腦立體定位儀，常規(guī)皮膚消毒，沿顱頂中線皮膚切開，暴顱骨及前囟，參照腦立體定位圖譜(Paxinos和Watson的大鼠腦立體定位圖譜)定位第三腦室〔4〕，利用螺絲釘及玻璃離子水門汀固定套管并縫合皮膚，術后單籠喂養(yǎng)并預防性使用青霉素。第三腦室置管術后第5天，套管內(nèi)輸注血管緊張素Ⅱ10 ng(10 ng 稀釋到10 μl生理鹽水中)，監(jiān)測大鼠飲水量，15 min飲水量<5 ml者予以剔除?；謴? d后，空白對照組(NCA和HFA組)第三腦室內(nèi)輸注人工腦脊液10 μl，陰性對照組(NCG和HFG組)輸注Ad-shGFP(109PFU)，干預組(NCN 和HFN組)輸注Ad-shNUCB2(109PFU)。輸注7 d后，低溫分離大鼠肝臟及其他組織并迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2Western印跡法檢測組織蛋白表達分別取肝臟、脂肪、肌肉等組織約100 mg，加入蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF、磷酸酶抑制劑氟化鈉、正釩酸鈉等進行勻漿，冰上裂解30 min，低溫高速離心30 min，取上清用BCA法測定蛋白濃度。每條泳道約加100 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)于PVDF膜，4℃封閉4 h后，依次加入稀釋的一抗、二抗反應，孵育過夜。經(jīng)洗脫后加入化學發(fā)光試劑并置化學發(fā)光成像系統(tǒng)中成像，用Quantity-One軟件進行圖像分析，計算各條帶灰度比。

1.3統(tǒng)計學處理使用SPSS19.0軟件，組間比較采用單因素ANOVA分析及獨立樣本t檢驗。

2結(jié)果

2.1中樞Ad-shNUCB2輸注對下丘腦及外周組織 nesfatin-1表達的影響與對照組比較，中樞Ad-shNUCB2 輸注后大鼠下丘腦 nesfatin-1表達明顯降低(P<0.05)，而外周組織(如肝、脂肪及肌肉)nesfatin-1表達無顯著變化(圖1，表1)。

2.2nesfatin-1表達下調(diào)對糖異生相關基因表達的影響和NCA相比，HFA組PEPCK和G6Pase蛋白的表達水平均明顯升高(P<0.05)；NCN組PEPCK和G6Pase的表達較NCA或NCG組均顯著升高(P<0.05)。同樣，HFN組在第三腦室輸注Ad-shNUCB2后，PEPCK和G6Pase蛋白的表達水平較HFA或HFG組也明顯升高(P<0.05)(圖2，表2)。

2.3nesfatin-1表達下調(diào)對IR、IRS-1及AKT蛋白活性的影響見圖3，表3。與NCA相比，HFA組IR、IRS-1及AKT磷酸化水平明顯下降(P<0.05)；NCN組在第三腦室輸注Ad-shNUCB2后IR、IRS-1及AKT磷酸化水平較NCA或NCG組均明顯下降(P<0.05)；HFN組在第三腦室輸注Ad-shNUCB2后IR、IRS-1及AKT磷酸化水平較HFA或HFG組均明顯降低(P<0.05)。

圖1　中樞 Ad-shNUCB2 對下丘腦及外周組織 nesfatin-1 表達的影響

圖2　中樞Ad-shNUCB2輸注對肝臟PEPCK及 G6Pase表達的影響

圖3　中樞 Ad-shNUCB2輸注對肝臟胰島素信號通路的影響

2.4nesfatin-1表達下調(diào)對肝臟 mTORC2及STAT3蛋白表達或活性的影響和NCA相比，HFA組mTOR、STAT3Tyr705及STAT3Ser727位點磷酸化水平明顯下降(P<0.05)；NCN組mTOR、STAT3Tyr705及STAT3Ser727位點磷酸化水平與NCA或NCG組比較均明顯下降(P<0.05)；HFN 組mTOR、STAT3Tyr705及STAT3Ser727位點磷酸化水平較HFA或HFG

表1　中樞 Ad-shNUCB2 對下丘腦及外周組織

與NCA組比較：1)P<0.05；與NCG組比較：2)P<0.05組表達水平也明顯降低(P<0.05)(圖4，表4)。

圖4　中樞Ad-shNUCB2輸注對肝臟STAT3及 mTOR活性的影響

指標NCANCGNCNHFAHFGHFNPEPCK0.390±0.0430.530±0.0451)0.910±0.0741)2)1.146±0.061)2)3)1.280±0.0221)2)3)4)1.920±0.0981)2)3)4)5)G6Pase1.010±0.1001.020±0.1301)1.750±0.2301)2)1.880±0.2101)2)3)1.810±0.1801)2)3)4)3.000±0.3901)2)3)4)5)

與NCA組比較：1)P<0.05；與NCG組比較：2)P<0.05；與NCN組比較：3)P<0.05；與HFA組比較：4)P<0.05；與HFG組比較：5)P<0.05；下表同

表3　中樞Ad-shNUCB2輸注對肝臟IR，IRS-1，AKT蛋白活性的影響

表4　中樞Ad-shNUCB2輸注對肝臟STAT3 Tyr705，STAT3 Ser727，mTOR位點磷酸化水平的影響

3討論

在第三腦室Ad-shNUCB2輸注后，我們對大鼠下丘腦和外周組織的nesfatin-1表達進行了檢測，結(jié)果顯示第三腦室Ad-shNUCB2輸注可降低下丘腦nesfatin-1的表達，血肌肉及脂肪外周組織 nesfatin-1表達沒有發(fā)生變化，驗證了模型的效力，為后續(xù)研究提供了良好的實驗基礎。

肝糖異生是維護機體血糖處于穩(wěn)態(tài)的主要糖代謝途徑，肝糖異生增加是引起血糖升高及胰島素抵抗的最主要原因之一。PEPCK和G6Pase是調(diào)節(jié)機體糖異生的關鍵酶，大量研究表明，胰島素通過激活IR/IRS-1/AKT信號通路抑制PEPCK和G6Pase的表達，從而抑制肝臟糖異生〔5〕。本研究發(fā)現(xiàn)，無論普食喂養(yǎng)還是高脂喂養(yǎng)組，中樞Ad-shNUCB2輸注后，PEPCK和G6Pase表達量均顯著增高；中樞nesfatin-1表達下調(diào)能夠明顯抑制普食喂養(yǎng)或高脂喂養(yǎng)的大鼠肝臟IR、IRS-1及AKT磷酸化水平。課題組前期研究表明，中樞nesfatin-1表達下調(diào)能夠通過促進肝糖異生，加重高脂喂養(yǎng)誘導的大鼠胰島素抵抗程度。因此，結(jié)合前期研究結(jié)果，我們推測中樞nesfatin-1表達抑制可能通過抑制IR/IRS-1/AKT胰島素信號作用通路，進而上調(diào)PEPCK和G6Pase的表達，導致肝糖異生增加，促進機體胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展。

mTOR作為磷脂酰肌醇肌酶家族一員，可調(diào)控多種細胞的生長和分化〔6〕。近來，mTOR參與胰島素信號通路的調(diào)節(jié)引起眾多研究者的關注。目前已證實，mTOR存在兩種復合物，包括雷帕霉素敏感復合物mTORC1和雷帕霉素不敏感復合物mTORC2。mTORC1作用于S6K1，可增加IRS-1絲氨酸磷酸化從而降低胰島素敏感性〔7〕，而mTORC2主要通過作用于AKT絲氨酸磷酸化位點從而增加胰島素敏感性〔8〕。本研究顯示，中樞nesfatin-1表達下調(diào)能夠抑制mTOR 磷酸化水平，特別是在高脂喂養(yǎng)動物中。因此，我們推測中樞nesfatin-1可能主要通過下調(diào)mTORC2表達，抑制AKT磷酸化，進而干擾胰島素信號通路，對于具體的分子機制還有待于進一步研究證實。

STAT3信號通路影響機體攝食、肝糖循環(huán)和生殖功能，參與下丘腦leptin對能量和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)〔9〕。當受到外界刺激后，STAT3被一系列細胞因子和生長因子激活〔10〕，兩兩聚合轉(zhuǎn)位進入細胞核并激活目標基因。本研究顯示，高脂喂養(yǎng)能夠下調(diào)STAT3磷酸化水平，而中樞nesfatin-1能在此基礎上進一步抑制STAT3絲氨酸727(Ser727)和酪氨酸705(Tyr705)位點磷酸化水平。因此，nesfatin-1作為一種神經(jīng)信號肽，可能通過激活mTOR/STAT3信號通路，抑制糖異生關鍵酶PEPCK和G6Pase的表達，從而調(diào)節(jié)機體的肝糖異生，最終引起機體對胰島素敏感性的變化。

4參考文獻

1Oh-I S，Shimizu H，Satoh T，etal.Identification of nesfatin-1 as a satiety molecule in the hypothalamus〔J〕.Nature，2006；443：709-12.

2Stengel A，Goebel M，Yakubov I，etal.Identification and characterization of nesfatin-1 immunoreactivity in endocrine cell types of the rat gastric oxyntic mucosa〔J〕.Endocrinology，2009；150：232-8.

3Yang M，Zhang Z，Wang C，etal.Nesfatin-1 action in the brain increases insulin sensitivity through Akt kinase/AMP-dependent protein kinase/target of rapamycin complex 2 pathways in diet-induced insulin resistance〔J〕.Diabetes，2012；61：1959-68.

4Paxinos G，Watson C.The rat brain in stereotaxic coordinates〔M〕.New York：Academic Press，2007:45-6.

5Steinberg GR，Watt MJ，Ernst M，etal.Ciliary neurotrophic factor stimulates muscle glucose uptake by a PI3-kinase-dependent pathway that is impaired with obesity〔J〕.Diabetes,2009；58：830-9.

6Hay N，Sonenberg N.Upstream and downstream of mTOR〔J〕.Genes Dev，2004；18：1926-45.

7Hara K，Maruki Y，Long X，etal.Raptor，a binding partner of target of rapamycin(TOR)，mediates TOR action〔J〕.Cell，2002；110：177-89.

8Sarbassov DD，Guertin DA，Ali SM，etal.Phosphorylation and regulation of Akt/ PKB by the rictor-mTOR complex〔J〕.Science，2005；307：1098-101.

9Kim JH，Yoon MS，Chen J.Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) mediates amino acid inhibition of insulin signaling through Serine 727 Phosphorylation〔J〕.J Biol Chem，2009；284：35425-32.

10Senn JJ，Klover PJ，Nowak IA，etal.Suppressor of cytokine signaling-3 (SOCS-3)，a potential mediator of interleukin-6-dependent insulin resistance in hepatocytes〔J〕.J Biol Chem，2003；278：13740-6.

〔2014-09-25修回〕

(編輯郭菁)