嚴(yán)瑋桐

摘要：目的：探討高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定海水魚(yú)中嘌呤含量的方法和效果。方法：選擇新鮮的海鱸魚(yú)、黃花魚(yú)、鱈魚(yú)3種海水魚(yú)類(lèi)，建立HPLC檢測(cè)方案，優(yōu)化色譜條件后測(cè)定樣品不同部位的腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤含量。結(jié)果：4種嘌呤在0.1～400 mg/L的濃度范圍內(nèi)，具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均≥0.998，檢出限在0.047～0.106 mg/L，RSD在0.021%～0.689%，平均回收率在94.289%～102.919%。不同海水魚(yú)中的嘌呤含量差異明顯，總嘌呤含量海鱸魚(yú)>鱈魚(yú)>黃花魚(yú);同一海水魚(yú)不同部位的嘌呤含量差異明顯，總體上魚(yú)皮>內(nèi)臟>魚(yú)肉。結(jié)論：HPLC法測(cè)定海水魚(yú)中嘌呤含量的精密度高、回收率好，是一種可行的檢測(cè)方案。

關(guān)鍵詞：海水魚(yú);嘌呤;HPLC;含量測(cè)定;精密度

To Study the Determination of Purine in Marine Fish by HPLC

YAN Weitong

（Food Sub Center of Jiujiang Inspection， Testing and Certification Center， Jiujiang 332000， China）

Abstract： Objective： To investigate the method and effect of high performance liquid chromatography （HPLC） for the determination of purine in marine fish. Methods： three kinds of fresh sea bass， yellow croaker and cod were selected to establish an HPLC detection scheme. After optimizing the chromatographic conditions， the contents of adenine， guanine， hypoxanthine and xanthine in different parts of the sample were determined. Results： The four purines had a good linear relationship in the concentration range of 0.1～400 mg/L， the correlation coefficient were all ≥0.998， the detection limit was 0.047～0.106 mg/L， the RSD was 0.021%～0.689%， and the average recovery was 94.289%～102.919%. The total purine content of sea bass>cod>yellow croaker; The purine content in different parts of fish in the same sea water was significantly different， in general， fish skin>viscera>fish meat. Conclusion： HPLC is a feasible method for the determination of purine in marine fish with high precision and good recovery.

Keywords： marine fish; purine; HPLC; content determination; precision

1 材料與方法

1.1 原料

本次試驗(yàn)所用的海水魚(yú)，選擇新鮮的海鱸魚(yú)、黃花魚(yú)、鱈魚(yú)3種魚(yú)類(lèi)，均購(gòu)置某水產(chǎn)市場(chǎng)。

1.2 儀器和試劑

電子天平、HPLC儀、pH計(jì)、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、超聲清洗器、冷凍高速離心機(jī)、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、絞肉機(jī)、電熱恒溫水槽和超純水系統(tǒng)等。

色譜級(jí)的腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤，純度均>99%;色譜純甲醇、四丁基氫氧化銨、冰乙酸、三氟乙酸;分析純甲酸、高氯酸等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

（1）流動(dòng)相。參考曲欣[1]的研究，色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm;流動(dòng)相：水-甲醇-冰乙酸-20%四丁基氫氧化銨，體積比：879∶100∶15∶6;柱溫：30 ℃，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳流速和檢測(cè)波長(zhǎng)。

（2）流速。流動(dòng)相確定后，選擇3種流速分離嘌呤，分別是0.8 mL/min、1 mL/min、1.2 mL/min，對(duì)比確定最佳流速。結(jié)果顯示：這3種流速均能在10 min內(nèi)完成嘌呤的分離，其中0.8 mL/min分離效果最好，峰型最明顯，因此確定最佳流速是0.8 mL/min。

（3）檢測(cè)波長(zhǎng)。配置嘌呤溶液，濃度為10 mg/L，然后進(jìn)行全光譜掃描，設(shè)置范圍在200～400 nm，從而確定適宜檢測(cè)波長(zhǎng)。結(jié)果顯示：嘌呤溶液在200～300 nm有吸收峰，腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤的最大吸收波長(zhǎng)分別是265 nm、271 nm、254 nm、278 nm。INAZAWA[2]的研究中，波長(zhǎng)選擇為260 nm;其他學(xué)者的研究中有254 nm、255 nm等[3-4]。本次試驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)幾種波長(zhǎng)的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有明顯差異，最終選擇254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

經(jīng)過(guò)優(yōu)化，最終確定色譜條件：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱，4.6 mm×250 mm，5 μm;流動(dòng)相是水-甲醇-冰乙酸-20%四丁基氫氧化銨，體積比為879∶100∶15∶6;柱溫30 ℃，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.2 樣品處理

對(duì)海水魚(yú)樣品進(jìn)行處理，目前已知方法有超聲法、高氯酸法、混合酸法等。其中，超聲法雖然操作簡(jiǎn)單，但嘌呤的提取率低。高氯酸法操作步驟復(fù)雜，等待時(shí)間長(zhǎng)，容易生成氯氣，會(huì)危害人身健康?；旌纤岱ú粌H對(duì)嘌呤的提取率高，而且甲酸對(duì)嘌呤具有保護(hù)作用。本研究最終采用混合酸法進(jìn)行樣品處理，混合酸的組成是：三氟乙酸和甲酸，兩者的體積比是1∶1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

配制單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，濃度為1 600 mg/L，置于冰箱內(nèi)在4 ℃恒溫下保存。取等體積4種嘌呤的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，濃度為4 00 mg/L。然后加入超純水稀釋處理，配制出不同濃度的溶液，分別是200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L和0.1 mg/L。這些溶液使用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，然后進(jìn)行色譜分析，檢出限是3倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度。

根據(jù)優(yōu)化后的色譜條件，檢測(cè)混合標(biāo)品中的嘌呤含量。以樣品濃度作為X軸，以峰面積作為Y軸，進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，得出回歸方程，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)R，見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，這4種嘌呤在0.1～400 mg/L的濃度范圍內(nèi)，具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)≥0.998，檢出限在0.047～0.106 mg/L。

2.2 精密度

采用優(yōu)化后的色譜條件，對(duì)300 mg/L的混合標(biāo)品連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)每一次的測(cè)定結(jié)果，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，6次進(jìn)樣測(cè)定值的RSD在0.021%～0.689，說(shuō)明該方法的精度較高。

2.3 加標(biāo)回收率

使用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)量海鱸魚(yú)的魚(yú)肉樣品2.4 g，平均分為12份，每份樣品0.2 g。采用混合酸法進(jìn)行處理，并根據(jù)優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。按照嘌呤含量的0.5倍、1.2倍，分別加入嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品，配制成不同濃度的樣品，每個(gè)樣品測(cè)定3次，計(jì)算回收率和RSD值，見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，4種嘌呤的平均回收率在94.289%～102.919%，說(shuō)明該方法處理樣品能減少嘌呤的損失量。

2.4 嘌呤含量測(cè)定結(jié)果

對(duì)3種海水魚(yú)樣品，分別選擇魚(yú)肉、魚(yú)皮和內(nèi)臟3個(gè)部位，按照1.3.2方法進(jìn)行處理，采用優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，得到4種嘌呤含量，并計(jì)算總嘌呤含量，見(jiàn)表4。分析可知：①不同海水魚(yú)中的嘌呤含量差異明顯，海鱸魚(yú)的次黃嘌呤和黃嘌呤含量最高，黃花魚(yú)的腺嘌呤含量最高，鱈魚(yú)的鳥(niǎo)嘌呤含量最高，總嘌呤含量海鱸魚(yú)>鱈魚(yú)>黃花魚(yú);②同一海水魚(yú)中，不同部位的嘌呤含量差異明顯，內(nèi)臟中的腺嘌呤和黃嘌呤含量最高，魚(yú)皮中的鳥(niǎo)嘌呤含量最高，魚(yú)肉中的次黃嘌呤含量最高，總體上魚(yú)皮>內(nèi)臟>魚(yú)肉。

3 結(jié)論

HPLC技術(shù)具有高壓、高速、高靈敏度、進(jìn)樣量少和環(huán)保的特點(diǎn)[5]。本次研究針對(duì)海鱸魚(yú)、黃花魚(yú)、鱈魚(yú)3種海水魚(yú)類(lèi)，建立HPLC檢測(cè)方案，優(yōu)化色譜條件后測(cè)定樣品不同部位的腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤含量，結(jié)論如下。

（1）選用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱，4.6 mm×250 mm，5 μm;以水-甲醇-冰乙酸-20%四丁基氫氧化銨為流動(dòng)相，體積比為879∶100∶15∶6;柱溫30 ℃，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，4種嘌呤在0.1～400 mg/L的濃度范圍內(nèi)，具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，精密度較高，回收率良好。

（2）總嘌呤含量方面：海鱸魚(yú)>鱈魚(yú)>黃花魚(yú);不同部位方面：魚(yú)皮>內(nèi)臟>魚(yú)肉。為避免人體內(nèi)嘌呤含量增高，預(yù)防高尿酸血癥和痛風(fēng)，提示人們少食用海鱸魚(yú)，合理食用鱈魚(yú)、黃花魚(yú);優(yōu)先食用魚(yú)肉，減少魚(yú)皮和內(nèi)臟的攝入量。

參考文獻(xiàn)

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[2]INAZAWA K，SATO A，KATO Y，et al.Determination and profiling of purines in foods by using HPLC and LC-MS[J].Nucleosides， Nucleotides and Nucleic Acids，2014，33（4/6）：439-444.

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