郭 偉， 黃江華， 吳 蓓， 陳 芳， 何曉華

（綿陽市三臺縣人民醫(yī)院檢驗科，四川 綿陽 621100）

腸球菌是臨床重要的條件致病菌，可以引起血流感染、心內(nèi)膜炎、尿路感染、呼吸道感染、腹腔感染和傷口感染等多種嚴重感染。腸球菌比其他革蘭陽性細菌具有更強的天然耐藥性，且很容易通過各種機制獲得耐藥基因，進而產(chǎn)生多重、高水平耐藥菌株，給臨床抗感染治療帶來許多困擾，尤其是萬古霉素耐藥腸球菌（vancomycin resistantEnterococcus，VRE）。

耐藥和毒力是細菌生存的主要機制。由于存活的需要，細菌更趨向于向獲得耐藥性和強毒力方向進化，隨著時間的推移，高耐藥兼具高毒力菌株越來越多[1]。腸球菌的耐藥性使治療難度大增，而增強的毒力又促進了細菌的定植和致人感染[2-3]，導致患者腸球菌感染率和病死率不斷上升。本研究對腸球菌的耐藥性和毒力基因進行分析，以期為腸球菌感染的防控和治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2016年1月—2018年7月分離自綿陽市三臺縣人民醫(yī)院住院和門診患者臨床樣本的非重復腸球菌889株，其中屎腸球菌485株、糞腸球菌404株。質控菌株糞腸球菌（ATCC 29212）購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定和體外藥物敏感性試驗 采用VITEK 2 Compact自動化鑒定藥敏儀（法國生物梅里埃公司）鑒定菌株，采用VITEK 2 Compact自動化鑒定藥敏儀和紙片擴散法（紙片購自英國Oxid公司）對所有分離菌株進行20種常用抗菌藥物的體外藥物敏感性試驗，結果判讀參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2017年標準。

1.2.2 毒力基因檢測 采用細菌基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取52株VRE[（耐萬古霉素屎腸球菌（vancomycinresistantEnterococcus faecium，VREfm）47株、耐萬古霉素糞腸球菌（vancomycin-resistantEnterococcus faecalis，VREfs）5株）]和31株隨機選取的萬古霉素敏感屎腸球菌（vancomycin sensitiveEnterococcus faecium，VSEfm）基因組DNA，采用NanoDrop 1000紫外分光光度儀（美國賽默飛世爾公司）測定其濃度和純度。依據(jù)文獻[4]設計引物（表1），委托生工生物（工程）上海有限公司合成。采用C1000 TMThermal Cycle PCR 擴增儀（美國伯樂公司） 檢測上述菌株基因組DNA中ace、asa1、cylA、efaA、esp、gelE、acm、cpd和hyl毒力基因。反應體系為25 μL，包括10 μL Premix Taq混合液[含dNTP、DNA聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液]（長沙芯科生物科技有限公司）、10 μmol/L上游和下游引物、100 ng DNA模板。擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃5 min。采用溴化乙錠預染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測各目的基因擴增片段后，委托生工生物工程（上海）有限公司測序，采用Blast軟件進行序列比對[5]。

表1 毒力基因擴增引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用例或率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腸球菌體外藥物敏感性

2種腸球菌對20種抗菌藥物均有不同程度的耐藥，且耐藥率和耐藥譜不同。屎腸球菌中耐紅霉素、環(huán)丙沙星、青霉素、苯唑西林、左氧氟沙星和氨芐西林的菌株所占比例較高（＞70%），而糞腸球菌對克林霉素、苯唑西林、奎奴普丁/達洛平和四環(huán)素的耐藥率＞70%。屎腸球菌和糞腸球菌中，VRE的檢出率分別為9.7%（47/485）和1.2%（5/404）；利奈唑胺耐藥菌株檢出率分別為0.6%（3/485）和1.7%（7/405）。屎腸球菌對阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、呋喃妥因、紅霉素、環(huán)丙沙星、利福平、莫西沙星、青霉素、萬古霉素和左氧氟沙星的耐藥率顯著高于糞腸球菌（χ2值分別為296.396、385.625、316.238、25.408、156.702、23.876、111.508、409.286、28.766、188.418，P＜0.001），對苯唑西林、克林霉素、奎奴普丁/達洛平和四環(huán)素的耐藥率則顯著低于糞腸球菌（χ2值分別為16.502、88.831、452.94、36.356，P＜0.001），見表2。

表2 485株屎腸球菌和404株糞腸球菌的藥物敏感性 株（%）

2.2 VRE體外藥物敏感性

2種V R E對替加環(huán)素均敏感；9 7.9%（46/47）的VREfm對克林霉素、紅霉素、氨芐西林、青霉素、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥，對高濃度慶大霉素和高濃度鏈霉素的耐藥率分別為55.3%（26/47）和12.8%（6/47），檢出1株VREfm對利奈唑胺耐藥；5株VREfs對高濃度慶大霉素、高濃度鏈霉素和呋喃妥因敏感，但對克林霉素、奎奴普丁/達福普丁、紅霉素、氨芐西林和青霉素耐藥率較高，見表3。

2.3 VRE 9種毒力基因檢出率比較

47株VREfm均檢出esp、acm毒力基因，但均未檢出asa1、ace和cpd毒力基因；5株VREfs檢出esp、acm、efaA毒力基因，但均未檢出asa1、cylA、Ace和cpd毒力基因。廣泛分布于VRE中的5種毒力基因的陽性率由高到低依次為：esp（100%）、acm（100%）、hyl（80.77%）、efaA（40.38%）和gelE（5.77%）。VREfm的毒力基因esp、acm和hyl的檢出率明顯高于VSEfm（χ2=28.157、17.391、18.311，P＜0.001）。見表4。部分基因擴增凝膠電泳圖見圖1。

2.4 VRE毒力基因攜帶模式

52株VRE均至少攜帶2種毒力基因。47株VREfm中esp-acm-hyl3基因攜帶率（55.32%，26/47）最高，其次為esp-acm-hyl-efaA（19.15%，9/47）和esp-acm雙基因攜帶率（10.60%，5/47）。5株VREfs均同時攜帶3～5種毒力基因。見表5 。

表3 52株VRE菌株的藥物敏感性 株（%）

表4 毒力基因檢出率 株（%）

圖1 部分VREfs基因擴增凝膠電泳圖

表5 VRE菌株毒力基因攜帶模式

3 討論

本研究分析了485株屎腸球菌和404株糞腸球菌對20種常見抗菌藥物的耐藥性，并對52株VRE和31株VSEfm進行了毒力基因檢測，結果顯示三臺縣人民醫(yī)院腸球菌耐藥情況較嚴重，對20種常用抗菌藥物均不同程度耐藥，對青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率最高，可能與這3類抗菌藥物作為臨床常用藥在臨床的長期使用有關。萬古霉素常被用于治療革蘭陽性菌感染，但由于VRE的出現(xiàn)使患者感染率迅速上升，給臨床治療帶來巨大困擾。更為嚴重的是，VRE還可以將耐藥基因水平傳遞給毒力更強的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA），導致萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌（vancomycin resistantStaphylococcus aureus，VRSA）的出現(xiàn)，VRSA的出現(xiàn)和傳播，會給革蘭陽性菌的抗感染治療帶來更大的困難。本研究485株屎腸球菌和404株糞腸球菌中，分別有9.7%（47/485）和1.2%（5/404）為VRE，VRE分離率明顯高于既往研究[6-7]。另外，本研究檢出對治療VRE的首選藥物利奈唑胺的耐藥菌株，提示臨床應加大規(guī)范、合理使用抗菌藥物的力度。

有研究結果顯示，屎腸球菌的耐藥性及獲得耐藥的能力均比糞腸球菌強[6-9]。本研究中，屎腸球菌大多對紅霉素、青霉素、苯唑西林、氨芐西林、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥，糞腸球菌大多對克林霉素、苯唑西林、奎奴普丁-達福普丁和四環(huán)素耐藥；屎腸球菌對阿莫西林、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、呋喃妥因、環(huán)丙沙星、莫西沙星、苯唑西林、萬古霉素和左氧氟沙星的耐藥率高于糞腸球菌，對苯唑西林、克林霉素、奎奴普丁/達福普丁和四環(huán)素的耐藥率則低于糞腸球菌，且VREfm比VREfs多，與相關報道[6，10]基本一致。2種VRE的耐藥率和耐藥譜不同，提示這2種菌株所面對的環(huán)境壓力可能不同，或者有可能在面對同樣的抗菌藥物選擇壓力時，2種VRE選擇了不同的進化方向。這也提示我們在臨床微生物檢驗中需將腸球菌鑒定到種，臨床在腸球菌感染的治療過程中應有針對性地區(qū)別用藥。總之，長期進行腸球菌耐藥性的監(jiān)測，觀察其分布特點，分析其耐藥變化，對腸球菌感染的防控十分必要。

細菌耐藥性增強導致感染治療難度加大，毒力的獲得使細菌更容易在宿主體內(nèi)定植，使得近年來患者腸球菌感染率、病死率呈明顯上升趨勢。FERNANDES等[11]的研究結果表明，107株腸球菌中沒有1株是完全沒有毒力基因的分離株。本研究中，VREfm和VSEfm相比，毒力基因esp、acm和hyl的檢出率明顯升高（χ2=28.157、17.391、18.311，P＜0.001）。52株VRE均表現(xiàn)為攜帶多種毒力基因，糞腸球菌全部攜帶3種及以上毒力基因，屎腸球菌攜帶3種及以上毒力基因的菌株所占比例高達89.36%（42/47）。提示三臺縣人民醫(yī)院腸球菌也已向同時獲得耐藥性和毒力進化，臨床應加強防控。

細菌的致感染能力與其毒力呈高度正相關，臨床上腸球菌所致感染中以糞腸球菌感染最為多見，其次為屎腸球菌。糞腸球菌的毒力因子更為明顯，或許可以解釋其在腸球菌感染中的主導作用[12]。但近年來，由于屎腸球菌毒力基因的獲得能力增強[13]導致其致病力增強，從而使得屎腸球菌感染率上升[1]。本研究中，屎腸球菌和糞腸球菌的感染率沒有顯著差異，似乎也印證了這一現(xiàn)象。另外，2種VRE攜帶的毒力基因類型都主要是esp、acm、hyl和efaA，且都表現(xiàn)為多基因攜帶，屎腸球菌3種及以上基因攜帶率為100%（5/5），糞腸球菌為89.36%（42/47）。由于本研究VREfs僅有5株，兩者間的毒力基因攜帶率差異可能被高估，提示2種VRE的毒力基因攜帶率、毒力基因攜帶數(shù)目與類型差異可能不大，表明屎腸球菌的毒力特征越來越明顯，原因可能是屎腸球菌在不斷進化的過程中可以從外界攝取新的基因，形成新的毒力。建議密切觀察屎腸球菌毒力基因的獲得情況，重視其致病能力的增強，為臨床治療提供參考。