郭 偉， 黃江華， 吳 蓓， 陳 芳， 何曉華

（綿陽市三臺(tái)縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 綿陽 621100）

腸球菌是臨床重要的條件致病菌，可以引起血流感染、心內(nèi)膜炎、尿路感染、呼吸道感染、腹腔感染和傷口感染等多種嚴(yán)重感染。腸球菌比其他革蘭陽性細(xì)菌具有更強(qiáng)的天然耐藥性，且很容易通過各種機(jī)制獲得耐藥基因，進(jìn)而產(chǎn)生多重、高水平耐藥菌株，給臨床抗感染治療帶來許多困擾，尤其是萬古霉素耐藥腸球菌（vancomycin resistantEnterococcus，VRE）。

耐藥和毒力是細(xì)菌生存的主要機(jī)制。由于存活的需要，細(xì)菌更趨向于向獲得耐藥性和強(qiáng)毒力方向進(jìn)化，隨著時(shí)間的推移，高耐藥兼具高毒力菌株越來越多[1]。腸球菌的耐藥性使治療難度大增，而增強(qiáng)的毒力又促進(jìn)了細(xì)菌的定植和致人感染[2-3]，導(dǎo)致患者腸球菌感染率和病死率不斷上升。本研究對(duì)腸球菌的耐藥性和毒力基因進(jìn)行分析，以期為腸球菌感染的防控和治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2016年1月—2018年7月分離自綿陽市三臺(tái)縣人民醫(yī)院住院和門診患者臨床樣本的非重復(fù)腸球菌889株，其中屎腸球菌485株、糞腸球菌404株。質(zhì)控菌株糞腸球菌（ATCC 29212）購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定和體外藥物敏感性試驗(yàn) 采用VITEK 2 Compact自動(dòng)化鑒定藥敏儀（法國生物梅里埃公司）鑒定菌株，采用VITEK 2 Compact自動(dòng)化鑒定藥敏儀和紙片擴(kuò)散法（紙片購自英國Oxid公司）對(duì)所有分離菌株進(jìn)行20種常用抗菌藥物的體外藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果判讀參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2017年標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 毒力基因檢測 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取52株VRE[（耐萬古霉素屎腸球菌（vancomycinresistantEnterococcus faecium，VREfm）47株、耐萬古霉素糞腸球菌（vancomycin-resistantEnterococcus faecalis，VREfs）5株）]和31株隨機(jī)選取的萬古霉素敏感屎腸球菌（vancomycin sensitiveEnterococcus faecium，VSEfm）基因組DNA，采用NanoDrop 1000紫外分光光度儀（美國賽默飛世爾公司）測定其濃度和純度。依據(jù)文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)引物（表1），委托生工生物（工程）上海有限公司合成。采用C1000 TMThermal Cycle PCR 擴(kuò)增儀（美國伯樂公司） 檢測上述菌株基因組DNA中ace、asa1、cylA、efaA、esp、gelE、acm、cpd和hyl毒力基因。反應(yīng)體系為25 μL，包括10 μL Premix Taq混合液[含dNTP、DNA聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液]（長沙芯科生物科技有限公司）、10 μmol/L上游和下游引物、100 ng DNA模板。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。采用溴化乙錠預(yù)染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測各目的基因擴(kuò)增片段后，委托生工生物工程（上海）有限公司測序，采用Blast軟件進(jìn)行序列比對(duì)[5]。

表1 毒力基因擴(kuò)增引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸球菌體外藥物敏感性

2種腸球菌對(duì)20種抗菌藥物均有不同程度的耐藥，且耐藥率和耐藥譜不同。屎腸球菌中耐紅霉素、環(huán)丙沙星、青霉素、苯唑西林、左氧氟沙星和氨芐西林的菌株所占比例較高（＞70%），而糞腸球菌對(duì)克林霉素、苯唑西林、奎奴普丁/達(dá)洛平和四環(huán)素的耐藥率＞70%。屎腸球菌和糞腸球菌中，VRE的檢出率分別為9.7%（47/485）和1.2%（5/404）；利奈唑胺耐藥菌株檢出率分別為0.6%（3/485）和1.7%（7/405）。屎腸球菌對(duì)阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、呋喃妥因、紅霉素、環(huán)丙沙星、利福平、莫西沙星、青霉素、萬古霉素和左氧氟沙星的耐藥率顯著高于糞腸球菌（χ2值分別為296.396、385.625、316.238、25.408、156.702、23.876、111.508、409.286、28.766、188.418，P＜0.001），對(duì)苯唑西林、克林霉素、奎奴普丁/達(dá)洛平和四環(huán)素的耐藥率則顯著低于糞腸球菌（χ2值分別為16.502、88.831、452.94、36.356，P＜0.001），見表2。

表2 485株屎腸球菌和404株糞腸球菌的藥物敏感性 株（%）

2.2 VRE體外藥物敏感性

2種V R E對(duì)替加環(huán)素均敏感；9 7.9%（46/47）的VREfm對(duì)克林霉素、紅霉素、氨芐西林、青霉素、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥，對(duì)高濃度慶大霉素和高濃度鏈霉素的耐藥率分別為55.3%（26/47）和12.8%（6/47），檢出1株VREfm對(duì)利奈唑胺耐藥；5株VREfs對(duì)高濃度慶大霉素、高濃度鏈霉素和呋喃妥因敏感，但對(duì)克林霉素、奎奴普丁/達(dá)福普丁、紅霉素、氨芐西林和青霉素耐藥率較高，見表3。

2.3 VRE 9種毒力基因檢出率比較

47株VREfm均檢出esp、acm毒力基因，但均未檢出asa1、ace和cpd毒力基因；5株VREfs檢出esp、acm、efaA毒力基因，但均未檢出asa1、cylA、Ace和cpd毒力基因。廣泛分布于VRE中的5種毒力基因的陽性率由高到低依次為：esp（100%）、acm（100%）、hyl（80.77%）、efaA（40.38%）和gelE（5.77%）。VREfm的毒力基因esp、acm和hyl的檢出率明顯高于VSEfm（χ2=28.157、17.391、18.311，P＜0.001）。見表4。部分基因擴(kuò)增凝膠電泳圖見圖1。

2.4 VRE毒力基因攜帶模式

52株VRE均至少攜帶2種毒力基因。47株VREfm中esp-acm-hyl3基因攜帶率（55.32%，26/47）最高，其次為esp-acm-hyl-efaA（19.15%，9/47）和esp-acm雙基因攜帶率（10.60%，5/47）。5株VREfs均同時(shí)攜帶3～5種毒力基因。見表5 。

表3 52株VRE菌株的藥物敏感性 株（%）

表4 毒力基因檢出率 株（%）

圖1 部分VREfs基因擴(kuò)增凝膠電泳圖

表5 VRE菌株毒力基因攜帶模式

3 討論

本研究分析了485株屎腸球菌和404株糞腸球菌對(duì)20種常見抗菌藥物的耐藥性，并對(duì)52株VRE和31株VSEfm進(jìn)行了毒力基因檢測，結(jié)果顯示三臺(tái)縣人民醫(yī)院腸球菌耐藥情況較嚴(yán)重，對(duì)20種常用抗菌藥物均不同程度耐藥，對(duì)青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率最高，可能與這3類抗菌藥物作為臨床常用藥在臨床的長期使用有關(guān)。萬古霉素常被用于治療革蘭陽性菌感染，但由于VRE的出現(xiàn)使患者感染率迅速上升，給臨床治療帶來巨大困擾。更為嚴(yán)重的是，VRE還可以將耐藥基因水平傳遞給毒力更強(qiáng)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA），導(dǎo)致萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌（vancomycin resistantStaphylococcus aureus，VRSA）的出現(xiàn)，VRSA的出現(xiàn)和傳播，會(huì)給革蘭陽性菌的抗感染治療帶來更大的困難。本研究485株屎腸球菌和404株糞腸球菌中，分別有9.7%（47/485）和1.2%（5/404）為VRE，VRE分離率明顯高于既往研究[6-7]。另外，本研究檢出對(duì)治療VRE的首選藥物利奈唑胺的耐藥菌株，提示臨床應(yīng)加大規(guī)范、合理使用抗菌藥物的力度。

有研究結(jié)果顯示，屎腸球菌的耐藥性及獲得耐藥的能力均比糞腸球菌強(qiáng)[6-9]。本研究中，屎腸球菌大多對(duì)紅霉素、青霉素、苯唑西林、氨芐西林、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥，糞腸球菌大多對(duì)克林霉素、苯唑西林、奎奴普丁-達(dá)福普丁和四環(huán)素耐藥；屎腸球菌對(duì)阿莫西林、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、呋喃妥因、環(huán)丙沙星、莫西沙星、苯唑西林、萬古霉素和左氧氟沙星的耐藥率高于糞腸球菌，對(duì)苯唑西林、克林霉素、奎奴普丁/達(dá)福普丁和四環(huán)素的耐藥率則低于糞腸球菌，且VREfm比VREfs多，與相關(guān)報(bào)道[6，10]基本一致。2種VRE的耐藥率和耐藥譜不同，提示這2種菌株所面對(duì)的環(huán)境壓力可能不同，或者有可能在面對(duì)同樣的抗菌藥物選擇壓力時(shí)，2種VRE選擇了不同的進(jìn)化方向。這也提示我們在臨床微生物檢驗(yàn)中需將腸球菌鑒定到種，臨床在腸球菌感染的治療過程中應(yīng)有針對(duì)性地區(qū)別用藥?？傊?，長期進(jìn)行腸球菌耐藥性的監(jiān)測，觀察其分布特點(diǎn)，分析其耐藥變化，對(duì)腸球菌感染的防控十分必要。

細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)導(dǎo)致感染治療難度加大，毒力的獲得使細(xì)菌更容易在宿主體內(nèi)定植，使得近年來患者腸球菌感染率、病死率呈明顯上升趨勢。FERNANDES等[11]的研究結(jié)果表明，107株腸球菌中沒有1株是完全沒有毒力基因的分離株。本研究中，VREfm和VSEfm相比，毒力基因esp、acm和hyl的檢出率明顯升高（χ2=28.157、17.391、18.311，P＜0.001）。52株VRE均表現(xiàn)為攜帶多種毒力基因，糞腸球菌全部攜帶3種及以上毒力基因，屎腸球菌攜帶3種及以上毒力基因的菌株所占比例高達(dá)89.36%（42/47）。提示三臺(tái)縣人民醫(yī)院腸球菌也已向同時(shí)獲得耐藥性和毒力進(jìn)化，臨床應(yīng)加強(qiáng)防控。

細(xì)菌的致感染能力與其毒力呈高度正相關(guān)，臨床上腸球菌所致感染中以糞腸球菌感染最為多見，其次為屎腸球菌。糞腸球菌的毒力因子更為明顯，或許可以解釋其在腸球菌感染中的主導(dǎo)作用[12]。但近年來，由于屎腸球菌毒力基因的獲得能力增強(qiáng)[13]導(dǎo)致其致病力增強(qiáng)，從而使得屎腸球菌感染率上升[1]。本研究中，屎腸球菌和糞腸球菌的感染率沒有顯著差異，似乎也印證了這一現(xiàn)象。另外，2種VRE攜帶的毒力基因類型都主要是esp、acm、hyl和efaA，且都表現(xiàn)為多基因攜帶，屎腸球菌3種及以上基因攜帶率為100%（5/5），糞腸球菌為89.36%（42/47）。由于本研究VREfs僅有5株，兩者間的毒力基因攜帶率差異可能被高估，提示2種VRE的毒力基因攜帶率、毒力基因攜帶數(shù)目與類型差異可能不大，表明屎腸球菌的毒力特征越來越明顯，原因可能是屎腸球菌在不斷進(jìn)化的過程中可以從外界攝取新的基因，形成新的毒力。建議密切觀察屎腸球菌毒力基因的獲得情況，重視其致病能力的增強(qiáng)，為臨床治療提供參考。