劉存芬， 王 燕， 楊 溶， 胡麗香

（安寧市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 安寧 650300）

近年來，血流感染的發(fā)生率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)，血流感染病原菌的構(gòu)成發(fā)生了顯著的變化，且病原菌的耐藥性也逐漸提高[1]。了解和掌握病原菌的構(gòu)成情況，對(duì)于臨床治療有重要的作用[2]。大腸埃希菌是血流感染最常見的病原菌，其主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBL）和攜帶整合子[3]。本研究對(duì)安寧地區(qū)大腸埃希菌的耐藥性及ESBL基因型與整合子的關(guān)系進(jìn)行分析，以期掌握大腸埃希菌耐藥特點(diǎn)及流行趨勢(shì)，為治療和控制產(chǎn)ESBL大腸埃希菌感染提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集分離自2018年6月—2019年3月安寧地區(qū)醫(yī)共體醫(yī)院血流感染住院患者血液樣本的200株大腸埃希菌，患者男121例、女79例。質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 725922）和肺炎克雷伯菌（ATCC 700603，產(chǎn)SHV-12型），購自。

1.2 主要儀器與試劑

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀（德國Eppendorf公司），PCR試劑、DNA標(biāo)志物（北京生物有限公司），VITEK 2 Compact自動(dòng)化鑒定藥敏儀及配套鑒定卡（法國生物梅里埃公司）。

1.3 細(xì)菌鑒定與體外藥物敏感性試驗(yàn)

采用VITEK 2 Compact自動(dòng)化鑒定藥敏儀及配套鑒定卡分析菌株對(duì)氨曲南、阿米卡星、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢他啶、亞胺培南、慶大霉素、左氧氟沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑、氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林-克拉維酸、哌拉西林-他唑巴坦的耐藥性。依照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)2019年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀。采用VITEK 2 Compact自動(dòng)化鑒定藥敏儀對(duì)產(chǎn)ESBL菌株進(jìn)行篩選，并采用雙紙片法進(jìn)行確認(rèn)[4]。

1.4 ESBL基因分型檢測

采用煮沸法提取大腸埃希菌及接合子菌株基因組中的DNA，參考文獻(xiàn)[5]建立PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增相關(guān)耐藥基因，產(chǎn)物純化后送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序，引物序列見表1。采用多重PCR檢測SHV，嚴(yán)格按照儀器與試劑說明書要求進(jìn)行操作。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用WHONET 5.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率表示。

2 結(jié)果

2.1 體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

200株大腸埃希菌中有118株（59.00%）產(chǎn)ESBL。大腸埃希菌對(duì)氨芐西林-舒巴坦的耐藥率最高（83.23%），對(duì)亞胺培南的敏感率最高 （97.42%）。見表2。

表2 大腸埃希菌體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 產(chǎn)ESBL大腸埃希菌基因型分布

118株產(chǎn)ESBL菌株中，有105株（88.98%）擴(kuò)增到ESBL基因，其中11株同時(shí)檢出2種ESBLs基因型，3株同時(shí)檢出3種ESBL基因型。所有基因型別中，CTX-M型所占比例最高，其次是TEM和SHE。見表3。

表3 產(chǎn)ESBL大腸埃希菌基因型分布

2.3 ESBL基因分型與Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類整合子的陽性率

在不同基因型大腸埃希菌中，僅檢出Ⅰ類整合子，未檢出Ⅱ類、Ⅲ類整合子。CTX-M-1型攜帶Ⅰ類整合子菌株所占比例最高（72.41%），SHV型攜帶Ⅰ類整合子菌株所占比例最低（50.00%）。見表4。

表4 ESBL基因分型與Ⅰ類整合子的陽性率

3 討論

伴隨著抗菌藥物應(yīng)用范圍的日益廣泛，血流感染在醫(yī)院感染中的發(fā)生率逐漸增高。大腸埃希菌導(dǎo)致的感染是臨床中較為常見的革蘭陰性菌感染，也是導(dǎo)致血流感染患者死亡的主要原因。產(chǎn)ESBL是革蘭陰性菌抵抗β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物的主要機(jī)制。整合子與細(xì)菌多重耐藥和耐藥基因播散有密切的關(guān)系。陳艷華等[6]發(fā)現(xiàn)腫瘤患者中大腸埃希菌的基因型主要以TEM、CTX-M-13、CTX-M-1為主。張珍丹等[7]發(fā)現(xiàn)尿路感染患者耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重，大腸埃希菌基因型主要以TEM、CTX-M為主。

本研究分析了200株分離自血流感染患者的大腸埃希菌，發(fā)現(xiàn)ESBL陽性菌株占59.00%，大腸埃希菌對(duì)氨芐西林-舒巴坦的耐藥率最高（83.23%），對(duì)左氧氟沙星的中介率最高（17.14%），對(duì)亞培安南的敏感率最高（97.42%）。近年來，產(chǎn)ESBL大腸埃希菌呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)，這主要是ESBL會(huì)通過結(jié)合、轉(zhuǎn)化等形式促使耐藥基因在細(xì)菌間擴(kuò)散導(dǎo)致的。對(duì)于血流感染患者而言，感染的途徑比較多，主要有局部感染灶以及腸道黏膜屏障功能損傷等。同時(shí)，由于血流感染患者免疫功能較弱，在大量使用廣譜抗菌藥物的過程中，腸道內(nèi)敏感菌被殺滅，大腸埃希菌等過度滋生，進(jìn)而導(dǎo)致腸道內(nèi)菌群失調(diào)[8]。大腸埃希菌的產(chǎn)生對(duì)患者的預(yù)后有重要的影響，本研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌的耐藥性比較強(qiáng)，且對(duì)多種藥物均有耐藥性，但對(duì)亞胺培南較敏感。亞胺培南是一種碳青霉烯類抗菌藥物，具有抗菌譜廣、殺菌活性強(qiáng)的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床治療中，是臨床治療革蘭陰性菌感染的最佳藥物，被譽(yù)為針對(duì)多重耐藥革蘭陰性菌感染的最后一道防線。

不同地區(qū)ESBL型別有很大的差異，依據(jù)同源性可將其分為TEM、SHE以及CTX-M多種型別，目前最流行的基因型是TEM和SHE型，我國的流行基因型是CTX-M型。本研究結(jié)果表明，118株產(chǎn)ESBL菌株中，有105株擴(kuò)增到ESBL基因型，占88.98%，其中CTX-M型菌株的陽性檢出率最高（72.41%），其次是TEM型，提示安寧地區(qū)大腸埃希菌存在多種基因型，但主要以單基因型為主。

整合子是一類可移動(dòng)的基因元件，其在細(xì)菌耐藥的基因水平傳播方面占有重要的地位[9]。本研究僅檢出Ⅰ類整合子，其中CTX-M-1型攜帶Ⅰ類整合子檢出率最高，其次是CTX-M型和SHV-11型，SHV型攜帶Ⅰ類整合子的檢出率最低，與AL-AGAMY等[10]的研究結(jié)果一致。

總之，攜帶整合子和產(chǎn)ESBL是大腸埃希菌主要的耐藥機(jī)制。安寧地區(qū)大腸埃希菌ESBL陽性率比較高，基因型主要以CXT-M基因?yàn)橹?，且主要以攜帶Ⅰ類整合子為主。本研究結(jié)果有助于指導(dǎo)臨床合理使用抗感染藥物，減少ESBL在細(xì)菌間的播散，對(duì)感染性疾病的控制具有一定的價(jià)值。