徐凱紅， 牧啟田， 歐陽(yáng)桂芳， 嚴(yán) 笑

（寧波市第一醫(yī)院血液科，浙江 寧波 315000）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma ，MM）是一種不可治愈的血液系統(tǒng)常見(jiàn)腫瘤，臨床表現(xiàn)為不同程度的貧血、腎功能不全以及骨痛，總生存時(shí)間（overall survival，OS）一般為2～10年[1]。有研究結(jié)果表明，基因組在MM的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[2]。細(xì)胞遺傳學(xué)異常，如t（4；14）、del（17/17p）、t（14；16）、t（14；20）、非超二倍體等與MM預(yù)后不良相關(guān)，而t（11；14）通常預(yù)后較好[3]。因此，細(xì)胞遺傳學(xué)異常已成為MM危險(xiǎn)分層中最重要的部分，對(duì)預(yù)后和治療方案的選擇有重要指導(dǎo)作用。

近年來(lái)的新興檢測(cè)技術(shù)，特別是二代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)的出現(xiàn)，使細(xì)胞遺傳學(xué)分析具有更高的靈敏度和通量[4]。常規(guī)核型分析在MM細(xì)胞遺傳學(xué)和危險(xiǎn)分層中的作用似乎正在減弱[5]。本研究回顧性分析了153例MM患者的細(xì)胞遺傳學(xué)異常情況，評(píng)價(jià)細(xì)胞遺傳學(xué)分析在MM中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年10月—2018年10月經(jīng)國(guó)際骨髓瘤工作組標(biāo)準(zhǔn)被確診為MM的153例患者作為研究對(duì)象，其中男91例，女62例，年齡47～84歲，包括IgG型87例（56.9%）、IgA型32例（20.9%）、輕鏈型27例（17.6%）、不分泌型4例，IgD型3例，國(guó)際分期系統(tǒng)（international staging system，ISS）分期Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分別為36例、65例和52例。對(duì)所有對(duì)象的骨髓標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)R顯帶和間期熒光原位雜交（interphase fluorescencein situhybridization，iFISH）分析。所有患者選用以velcade為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)治療，48例（31.4%）隨后進(jìn)行自體造血干細(xì)胞移植，其他105例患者由于無(wú)法耐受，接受非強(qiáng)化治療。本研究經(jīng)寧波市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并取得患者知情同意。

1.2 染色體核型分析

骨髓細(xì)胞染色體核型分析采用常規(guī)R顯帶。加入秋水仙堿使其終濃度為0.1 ng/L，孵育50 min。用氯化鉀溶液進(jìn)行低滲處理并用甲醇冰醋酸混合液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定，細(xì)胞懸液制片后熱處理變性，最后染色觀(guān)察。至少觀(guān)察20個(gè)有絲分裂，核型描述按照《國(guó)際人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)命名系統(tǒng)》[6]進(jìn)行。將染色體數(shù)目≥47且＜75定義為超二倍體，將亞二倍體、假二倍體和近四倍體定義為非超二倍體[7]。

1.3 iFISH分析

對(duì)CD138純化的骨髓細(xì)胞進(jìn)行iFISH分析。選擇5個(gè)特異的DNA探針：針對(duì)17p13.1的LSI-TP53探針（美國(guó)雅培分子公司）、針對(duì)13q14不同位點(diǎn)缺失的LSI-RB1和LSI-D13S319探針（美國(guó)雅培分子公司）、針對(duì)14q32的LSI-IGH雙色分離重排探針（美國(guó)雅培分子公司）、針對(duì)1q21擴(kuò)增的1q21探針（廣州LBP醫(yī)藥科技有限公司）。探針和標(biāo)本DNA在73 ℃下變性5 min，用10 μL 6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，4'，DAPI）（德國(guó)羅氏公司）進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染。每個(gè)探針至少分析200個(gè)間期細(xì)胞。所有iFISH探針均采用陰性和陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行驗(yàn)證，當(dāng)陽(yáng)性信號(hào)百分比超過(guò)閾值時(shí)，則判定為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析結(jié)果

對(duì)153例MM進(jìn)行染色體核型分析，染色體異常的檢出率為28.1%（43/153）。69.8%的患者（30/43）同時(shí)存在數(shù)量和結(jié)構(gòu)上的異常（圖1）。單純的染色體數(shù)目異常多見(jiàn)于超二倍體，而單純結(jié)構(gòu)異常則僅見(jiàn)于非超二倍體（表1）。

圖1 異常染色體核型

表1 MM常規(guī)核型分析結(jié)果 例

細(xì)胞遺傳學(xué)異常主要集中在13號(hào)染色體（20/43，46.5%），其次是9、14、1號(hào)染色體（19/43，44.2%）和8號(hào)染色體（18/43，41.9%）上。染色體數(shù)目增加最常見(jiàn)于9號(hào)染色體（17例，39.5%），其次是5號(hào)和15號(hào)染色體（各10例，23.3%）；染色體缺失最常見(jiàn)于8號(hào)染色體（9例，20.9%），其次是13號(hào)染色體（7例，16.3%）和14號(hào)染色體（6例，14.0%）；染色體結(jié)構(gòu)異常最常見(jiàn)于1號(hào)染色體（15例，4.9%），其次是14號(hào)染色體（10例，23.3%）和13號(hào)染色體（9例，20.9%）。見(jiàn)圖2。

圖2 43例MM核型異常在具體染色體中的分布

2.2 iFISH檢測(cè)分析

采用5種常規(guī)探針，iFISH共檢出109例（71.2%）異常，其中最常見(jiàn)的異常是IGH重排，占55.6%（85例）；其次是1q21擴(kuò)增（82例，53.6%）、RB1缺失（64例，41.8%）、D13S319缺失（60例，39.2%）、TP53缺失（21例，13.7%）。其中，探針LSI-RB1和LSID13S319與13914雜交，2個(gè)位點(diǎn)缺失頻率無(wú)顯著差異（P＞0.05）。iFISH檢出只有1種異常的患者僅23例（21.1%），其他108例患者均同時(shí)出現(xiàn)2～5種異常。見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 iFISH檢出的5種細(xì)胞遺傳學(xué)異常

圖4 iFISH檢出的5種細(xì)胞遺傳學(xué)異常的分布

在153例MM患者中，R顯帶和iFISH聯(lián)合應(yīng)用可使細(xì)胞遺傳學(xué)異常的檢出率提高到79.1%（121/153）。121例檢出細(xì)胞遺傳學(xué)異常的患者中，9例MM患者R顯帶檢出核型異常，但iFISH陰性（表2），占所有細(xì)胞遺傳學(xué)異?；颊叩?.4%（9/121）。對(duì)9例患者隨訪(fǎng)至2020年1月10日，中位隨訪(fǎng)時(shí)間為3.1年（隨訪(fǎng)1.3～4.2年），其中有2例仍處于平臺(tái)期，其他7例無(wú)疾病進(jìn)展時(shí)間（progression-free survival，PFS）均＜3年，其中包括2例死于感染和心力衰竭的患者。

表2 9例iFISH檢測(cè)陰性的MM患者核型

3 討論

MM是一種基因復(fù)雜的腫瘤性疾病。細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的最新進(jìn)展表明，幾乎所有的MM患者都存在細(xì)胞遺傳學(xué)的異常[8]。新的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，尤其是NGS技術(shù)，雖然可以提供更多關(guān)于細(xì)胞遺傳學(xué)的信息，但由于成本高、缺乏統(tǒng)一規(guī)范等，導(dǎo)致應(yīng)用受到限制。iFISH是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)方法，是危險(xiǎn)分層和預(yù)后的主要基礎(chǔ)[9]。

在本研究中，iFISH異常的檢出率與文獻(xiàn)[10-11]相似，本研究使用探針LSI-RB1（13q14.1-14.2）和LSI-D13S319（13q14.3）與13q14雜交，2個(gè)位點(diǎn)缺失頻率無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。而且，本研究共有30例（34.9%）RB1和D13s319同時(shí)缺失，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證實(shí)這2個(gè)位點(diǎn)高度相關(guān)（r=0.966）。這一結(jié)果說(shuō)明，MM 13號(hào)染色體的異常多表現(xiàn)為13q的大片段缺失或整條13號(hào)染色體的缺失 。臨床上可只選取LSI-RB1或LSI-D13S319探針中的1種來(lái)檢測(cè)13q14的缺失。

在本研究中，MM染色體核型分析的檢出率與文獻(xiàn)報(bào)道相似[12-13]，且細(xì)胞遺傳學(xué)異常主要集中在13號(hào)染色體，其次是9、14、1號(hào)染色體和8號(hào)染色體上。有研究證實(shí)13號(hào)染色體缺失、14號(hào)染色體IGH重排、1q21擴(kuò)增和8號(hào)染色體畸變?cè)贛M發(fā)病機(jī)制中具有重要價(jià)值[14]，與本研究發(fā)現(xiàn)的遺傳學(xué)異常好發(fā)染色體一致。本研究還發(fā)現(xiàn)9號(hào)染色體的異常，且+9出現(xiàn)頻率較高。有研究者推測(cè)，位于9p21上的p16和p15抑癌基因拷貝數(shù)的增加，可能會(huì)使MM有良好的預(yù)后[15]，但對(duì)9號(hào)染色體的研究尚未見(jiàn)深入報(bào)道。由于超過(guò)1/3的MM患者存在9號(hào)染色體異常，且其生物學(xué)機(jī)制尚不清楚，值得進(jìn)一步研究。

iFISH結(jié)合染色體核型分析，細(xì)胞遺傳學(xué)異常檢出率可達(dá)79.1%。盡管iFISH在揭示遺傳學(xué)異常方面有很高的效率，但本研究中核型分析異常的患者中仍有7.4%（9/121）的患者iFISH檢測(cè)陰性。iFISH的效率很大程度上取決于探針的組成。雖然，使用足夠多的探針幾乎可以識(shí)別所有的細(xì)胞遺傳學(xué)異常，但是成本會(huì)大大增加。在臨床實(shí)踐中，iFISH探針只針對(duì)發(fā)病率較高或有預(yù)后意義的重復(fù)性異常，因此檢出效率受到影響。由于隨訪(fǎng)時(shí)間的限制，無(wú)法統(tǒng)計(jì)出所有的OS，我們統(tǒng)計(jì)了這9例患者的PFS，發(fā)現(xiàn)其中7例患者PFS＜3年；第1例和第2例伴有+3和/或+5的超二倍體，根據(jù)常規(guī)判斷，本該有良好的預(yù)后[15]，短期出現(xiàn)了疾病進(jìn)展可能是由于出現(xiàn)+21和≥2個(gè)額外的結(jié)構(gòu)染色體異常，文獻(xiàn)報(bào)道可導(dǎo)致較差的臨床預(yù)后[16-17]。第3例和第4例患者也均為超二倍體，但同時(shí)伴有8號(hào)染色體異常。研究證實(shí)，8p21的缺失可導(dǎo)致MM患者對(duì)硼替佐米耐藥，還可能導(dǎo)致相關(guān)基因（TRAIL-R4、CCDC25、RHOBTB2、PTK2B、SCARA3、MYC、BCL-2和TP53等）表達(dá)譜的改變，這些基因的表達(dá)與MM的發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系[18]。染色體8q24.1/c-myc異常也被認(rèn)為是高危骨髓瘤的一個(gè)標(biāo)志[19]。本研究也證實(shí)8號(hào)染色體是細(xì)胞遺傳學(xué)異常最集中的染色體之一，這些研究結(jié)果一定程度上解釋了本研究第3例和第4例患者預(yù)后欠佳的原因，其他5例均存在意義未明的結(jié)構(gòu)異常，由于沒(méi)有商品化的iFISH探針，因此無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。我們還發(fā)現(xiàn)大多數(shù)（78.9%）iFISH陽(yáng)性患者具有2種及以上異常，染色體核型分析也顯示，69.8%的MM同時(shí)存在染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)異常，這提示MM的預(yù)后是多基因共同作用的復(fù)雜細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)果。當(dāng)細(xì)胞遺傳學(xué)上預(yù)后良好和預(yù)后不良的特異性改變同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，具體臨床表現(xiàn)以哪一方占主導(dǎo)地位，尚需進(jìn)一步探討。

綜上所述，盡管核型分析在MM的細(xì)胞遺傳學(xué)分析中效率不高，但其能夠提供MM完整的細(xì)胞遺傳學(xué)信息，揭示商品化iFISH探針無(wú)法檢出的位點(diǎn)。大規(guī)模的染色體核型分析，有助于確定染色體上特定的位點(diǎn)，為進(jìn)一步的MM分子發(fā)病機(jī)制和化療靶向位點(diǎn)的研究提供參考。