呂麗華， 朱麗娜， 王 皓， 楊文靜， 金安莉， 王蓓麗， 潘柏申， 郭 瑋

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032）

細(xì)胞外囊泡是由細(xì)胞分泌的磷脂雙分子囊泡，外泌體是細(xì)胞外囊泡的一個(gè)重要分群，是直徑為40～100 nm的膜性囊泡狀小體[1]。外泌體是經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)吞運(yùn)輸途徑形成的，在形成過(guò)程中會(huì)攜帶細(xì)胞來(lái)源的活性分子，如核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等，可介導(dǎo)細(xì)胞之間的信號(hào)交流，在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程發(fā)揮重要作用[2-3]。外泌體的分離和鑒定對(duì)于研究其生物學(xué)功能及尋找疾病標(biāo)志物是最基礎(chǔ)也是最關(guān)鍵的步驟。目前，外泌體的提取方法包括超速離心法、膜親和法、沉淀法、免疫磁珠法、超濾法、排阻色譜法等[4-5]。本研究擬選擇超速離心法、膜親和法、沉淀法提取并鑒定血漿外泌體，旨在了解及驗(yàn)證不同方法提取血漿外泌體的效率。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)選取2018年12月—2019年2月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院進(jìn)行體檢的表面健康者8名，其中男4名、女4名，年齡21～36歲，所有對(duì)象體檢結(jié)果均在參考區(qū)間內(nèi)。采集所有對(duì)象靜脈血10 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，1 000×g離心10 min，分離血漿，然后4 ℃ 13 000×g離心15 min，用0.22 μm濾器過(guò)濾，按1 mL/管分裝，置于-80 ℃凍存。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 儀器與試劑

ExoQuick試劑盒（沉淀法）購(gòu)自美國(guó)System Biosciences公司。exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit（膜親和法）購(gòu)自美國(guó)QIAGEN公司。蛋白濃度測(cè)定試劑盒為Detergent Compatible Bradford Assay Kit，購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific公司。一抗抗體：CD63、TSG101購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，CD9購(gòu)自美國(guó)CST公司；二抗抗體：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體、羊抗兔IgG抗體購(gòu)自上海碧云天公司。 N30納米流式檢測(cè)儀（廈門(mén)福流生物科技有限公司），Zetasizer Nano ZS納米粒度及Zeta電位儀（英國(guó)Malvern公司），Tecnai Spirit G2 BioTWIN透射電子顯微鏡（簡(jiǎn)稱(chēng)透射電鏡，美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）。

1.3 血漿外泌體提取

取出凍存于-80 ℃的血漿，冰上融化，取1 mL，分別利用超速離心法、膜親和法和沉淀法提取血漿外泌體。

1.3.1 超速離心法 將1 mL血漿用36 mL 磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）稀釋?zhuān)尤隠-100XP超速離心機(jī)（SW32Ti轉(zhuǎn)子，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）的超速離心管中，配平，4 ℃ 100 000×g離心2 h，將上清緩慢吸去，留取最后1 mL沉淀，渦旋震蕩混勻，吸取至SW41Ti轉(zhuǎn)子配套的離心管中，用6 mL PBS稀釋?zhuān)b滿離心管，配平，再次4 ℃ 100 000×g離心2 h，緩慢吸去上清，最終用100 μL PBS重懸沉淀。

1.3.2 沉淀法 按ExoQuick試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，吸取1 mL血漿，加入沉淀劑253 μL，吹吸混勻，4 ℃靜置30 min，1 500×g離心30 min，棄上清，管底沉淀用100 μL PBS重懸沉淀。

1.3.3 膜親和法 按照說(shuō)明書(shū)要求，將Buffer XBP與過(guò)濾后的1 mL血漿樣本1∶1混勻后，轉(zhuǎn)移至分離柱中，500×g離心1 min，棄廢液；加入10 mL Buffer XWP至分離柱，5 000×g離心5 min；將分離柱轉(zhuǎn)移至新的收集管中，加入100 μL PBS至膜中央，室溫孵育5 min后，5 000×g離心5 min，所得樣本即為外泌體。

1.4 外泌體生物學(xué)特征鑒定與分析

1.4.1 外泌體的形態(tài) 取20 μL外泌體重懸液滴于電鏡專(zhuān)用銅網(wǎng)上，靜置3 min。隨后用2 %磷鎢酸溶液復(fù)染，室溫靜置5 min，用吸水濾紙吸干殘留的多余液體，在60 W白熾燈下靜置2～3 min，待樣本干燥后，置于透射電鏡下觀察形態(tài)。

1.4.2 外泌體的顆粒直徑 將已知直徑的熒光二氧化硅納米顆粒與外泌體樣本混合后，在N30納米流式檢測(cè)儀上選用波長(zhǎng)為532 nm的激光器，檢測(cè)通道為散射通道和PE熒光通道，對(duì)樣本混合體系進(jìn)行檢測(cè)。以系列二氧化硅納米顆粒的直徑及散射光強(qiáng)度繪制出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，對(duì)外泌體的折射率差異進(jìn)行校正，將外泌體的散射光強(qiáng)度轉(zhuǎn)變?yōu)橹睆絽?shù)，并計(jì)算出外泌體的顆粒直徑。

1.4.3 外泌體動(dòng)態(tài)光散射分析及Zeta電位測(cè)定 Zetasizer Nano ZS納米粒度及Zeta電位儀利用動(dòng)態(tài)光散射法原理分析樣本的粒徑分布情況，即體系中的顆粒因布朗運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生的散射光強(qiáng)度變化，檢測(cè)器將散射光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電流信號(hào)，再通過(guò)數(shù)字相關(guān)器的運(yùn)算得到顆粒在溶液中的擴(kuò)散系數(shù)，最后計(jì)算出顆粒直徑大小及其分布。將制備的外泌體懸液用PBS稀釋?zhuān)瑴u旋震蕩混勻，置于樣本池中。運(yùn)用Zetasizer軟件分析不同方法提取的外泌體的直徑范圍及Zeta電位。

1.4.4 外泌體蛋白的鑒定分析 外泌體蛋白懸液采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法進(jìn)行定量檢測(cè)，隨后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS -PAGE），濕轉(zhuǎn)1.5 h，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，三羥甲基氨基甲烷-吐溫（trishydroxymethyl aminomethane-Tween，TBST）緩沖液洗滌，孵育一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗滌后加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，隨后采用電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性分析。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，采用Welch's ANOVA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，事后檢驗(yàn)采用兩樣本不等方差t檢驗(yàn)[6]。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡鑒定3種方法提取的外泌體的形態(tài)

超速離心法、沉淀法和膜親和法提取的外泌體在透射電鏡下均能觀察到立體膜結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出茶托樣或凹半球樣，大小為40～100 nm，分散或聚集分布，但沉淀法混有較多的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和蛋白的聚沉物。見(jiàn)圖1。

2.2 外泌體的顆粒直徑

采用N30納米流式檢測(cè)儀檢測(cè)外泌體的顆粒直徑。超速離心法、膜親和法、沉淀法提取的外泌體顆粒直徑分別為65.5（55.5～77.5）、73.5（61.5～101.5）、64.5（54.5～77.5）nm。親和法提取的外泌體直徑大于超速離心法和沉淀法（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定外泌體直徑及Zeta電位

動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定超速離心法、膜親和法、沉淀法提取的外泌體直徑分別為190.1（164.2～220.2）、295.3（220.2～396.1）、68.06（37.84～122.4）nm，大于N30納米流式儀的檢測(cè)結(jié)果。此外，3種方法提取的外泌體膜的Zeta電位均為負(fù)電荷，提示其均為膜結(jié)構(gòu)。見(jiàn)圖3。

2.4 外泌體蛋白標(biāo)志物的鑒定

免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果表明，超速離心法、膜親和法、沉淀法提取的血漿外泌體均表達(dá)外泌體蛋白標(biāo)志物。見(jiàn)圖4。

2.5 外泌體提取效率評(píng)估及經(jīng)濟(jì)性比較

圖2 超速離心法、沉淀法和膜親和法提取的外泌體粒徑分布

圖3 動(dòng)態(tài)光散射法檢測(cè)外泌體的粒徑及Zeta電位

圖4 免疫印跡法鑒定外泌體蛋白標(biāo)志物

沉淀法提取的血漿外泌體蛋白總量和外泌體顆粒數(shù)均高于超速離心法和膜親和法（P＜0.05）。以外泌體顆粒數(shù)/蛋白總量比值表示外泌體的提取純度。超速離心法的提取純度高于膜親和法和沉淀法（P＜0.05）。超速離心法耗時(shí)且成本高，親和法耗時(shí)最少、成本中等，沉淀法成本最低。見(jiàn)圖5。

圖5 超速離心法、膜親和法、沉淀法提取外泌體的效率及經(jīng)濟(jì)性比較

3 討論

外泌體參與了細(xì)胞之間的信號(hào)交流，在疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，選擇合適的提取方法是研究外泌體的第一步。國(guó)際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)導(dǎo)則提出，鑒定樣本中存在細(xì)胞外囊泡的實(shí)驗(yàn)要求至少包括：（1）使用電子顯微鏡等對(duì)樣本進(jìn)行成像分析，證實(shí)膜泡結(jié)構(gòu)；（2）通過(guò)納米級(jí)別的分析技術(shù)測(cè)定膜泡群體的粒徑情況；（3）使用免疫印跡法或流式等技術(shù)檢測(cè)囊泡的蛋白標(biāo)志物[7]。

本研究采用超速離心法、膜親和法、沉淀法對(duì)血漿外泌體進(jìn)行提取和鑒定。結(jié)果顯示，在透射電鏡下，外泌體均為茶托樣或凹半球樣立體膜結(jié)構(gòu)。N30納米流式檢測(cè)儀的檢測(cè)結(jié)果顯示，膜親和法提取的外泌體直徑比超速離心法和沉淀法大。動(dòng)態(tài)光散射法檢測(cè)結(jié)果提示3種方法提取的外泌體均為膜性結(jié)構(gòu)。超速離心法提取的血漿外泌體純度最高，但最耗時(shí)、成本較高；膜親和法提取步驟耗時(shí)最少、成本中等；沉淀法提取的血漿外泌體蛋白質(zhì)濃度和顆粒數(shù)量最高、成本最低，但提取的純度遠(yuǎn)低于超速離心法。

采用透射電鏡觀察沉淀法提取的外泌體，提示有蛋白質(zhì)和PEG聚合物污染，與文獻(xiàn)報(bào)道[9]相符。這些聚沉物對(duì)后續(xù)外泌體生物功能研究是否有影響值得商榷。也有學(xué)者使用沉淀法在細(xì)胞培養(yǎng)基中提取出背景干凈、形態(tài)典型的外泌體[9]，這可能與樣本自身、外泌體提取過(guò)程或電鏡樣本制備等有關(guān)。

本研究采用N30納米流式檢測(cè)儀和動(dòng)態(tài)光散射法對(duì)外泌體進(jìn)行單顆粒層面的分析，彌補(bǔ)了前者不能測(cè)定外泌體的Zeta電位及后者不能計(jì)算顆粒數(shù)的缺陷，3種方法得到的血漿外泌體大小與文獻(xiàn)報(bào)道[6，10]一致。雖然本研究動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定外泌體的Zeta電位為負(fù)值，提示外泌體帶負(fù)電荷，可能為膜狀結(jié)構(gòu)，但該方法測(cè)定的外泌體粒徑偏大。此外，該技術(shù)對(duì)外泌體的檢測(cè)不具有特異性，同時(shí)記錄了其他顆粒的信息。有研究結(jié)果顯示，動(dòng)態(tài)光散射法對(duì)分布均一的單分散粒子群的檢測(cè)較準(zhǔn)確，但不適合細(xì)胞外囊泡的群體檢測(cè)[11]。

超速離心法、膜親和法、沉淀法提取的血漿外泌體均表達(dá)標(biāo)志性蛋白。超速離心法和膜親和法提取的外泌體表達(dá)的蛋白純度較高，這是因?yàn)樵谔崛∵^(guò)程中，血漿經(jīng)過(guò)至少2次高倍數(shù)的稀釋?zhuān)讶コ蟛糠盅獫{蛋白的污染，但不排除最后吸取樣本時(shí)仍有殘留蛋白。沉淀法提取的外泌體蛋白濃度最高，粒子數(shù)最多，這可能是因?yàn)橹羷└患饷隗w的同時(shí)會(huì)有大量其他囊泡或非囊泡組分與其發(fā)生共沉淀，造成結(jié)果假性增高，出現(xiàn)“高回收率、低特異性”的情況[11]。因此，通過(guò)顆粒數(shù)/蛋白總量比值評(píng)估外泌體提取效率時(shí)[12]，沉淀法的提取純度最低[13]。

綜上所述，超速離心法作為最經(jīng)典的方法，外泌體提取純度高，適合于體積大且外泌體量多的樣本，及于對(duì)外泌體純度要求嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)。考慮到超速離心離法耗時(shí)長(zhǎng)，1次檢測(cè)的樣本數(shù)量少，因此不適用于臨床常規(guī)檢測(cè)。膜親和法操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，也可有效提取外泌體，適用于外泌體RNA的相關(guān)研究[8]。沉淀法提取的外泌體量大，但混入的雜質(zhì)較多，不易分離出特異性外泌體。對(duì)于低豐度表達(dá)的外泌體分子，可采用多種提取方法聯(lián)合驗(yàn)證，提高其檢出率。研發(fā)新的提取方法、改良或結(jié)合現(xiàn)有方法，使外泌體分離達(dá)到“高回收率、高特異性”是未來(lái)的研究方向，可為外泌體真正應(yīng)用于臨床打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。