車宇，梁靜，楊怡萍，廖娟，王蒨，蔡英全，邵帥

（陜西省腫瘤醫(yī)院 放療科，陜西 西安 710061）

近年來，我國胃癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。胃癌早期多以燒心、腹脹不適及體重下降等亞臨床表現(xiàn)為主，許多患者就診時其胃癌已屬臨床晚期，失去了行根治性手術的機會。研究抑制胃癌生長的分子指標對提高胃癌患者手術切除率及改善患者長期預后具有重要作用。

MicroRNA 是單鏈的長度較短的RNA，通常其堿基數(shù)量為18 ～25 bp[2]。已發(fā)現(xiàn)許多與胃癌細胞增殖、轉移及腫瘤血管新生密切相關的microRNA[3-4]。microRNA-494（miR-494）是近年來新鑒定出的一種microRNA，在多種婦科腫瘤（包括子宮內膜癌及卵巢癌）中的表達水平顯著下調[5-6]。目前，miR-494 在胃癌中的表達水平及生物學功能尚不可知。筆者擬通過檢測miR-494 在胃癌組織及胃癌細胞MGC803 中的表達，探究miR-494 對胃癌細胞增殖、細胞周期及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標本

選取2015年1月—2018年1月被陜西省腫瘤醫(yī)院收治并行手術切除的60例患者的胃癌組織及對應癌旁組織（距腫瘤邊緣＞2 cm）標本。其中男性38例，女性22例；年齡37 ～68 歲，中位年齡53 歲。

1.2 細胞來源及主要試劑

MGC803 細胞由陜西省腫瘤醫(yī)院放療科實驗室保存。microRNA mimics 模擬物（miR-494 及陰性對照）、引物（miR-494 及U6）購自廣州復能基因有限公司及廣州銳博生物科技有限公司，DMEM 培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco 公司，Trizol、Lipofectamine?2000、SuperScript? One-Step RT-PCR System with Platinum? Taq DNA Polymerase 及DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit 購自美國Invitrogen 公司，細胞周期蛋 白D1（CyclinD1） 抗 體（ab494175） 及β-actin抗體（ab8226）購自美國Abcam 公司，MTT 藥物、Annexin-V/PI 細胞周期及凋亡檢測試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 PCR

按Trizol 試劑說明書提取胃癌組織、癌旁組織及MGC803 細胞RNA，分別組建RT-PCR 及realtime PCR 反應體系。RT-PCR 反應條件：50℃逆轉錄30 min，94℃變性2 min，共1 個循環(huán)。real-time PCR反應條件：94℃變性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸3 min，共40 個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min。通過2-△△Ct法計算miR-494 及CyclinD1 mRNA 的相對表達量。

1.4 細胞培養(yǎng)及mimics 轉染

培養(yǎng)MGC803 細胞至穩(wěn)定傳代，將MGC803 細胞以合適密度接種于6 孔板中，過夜培養(yǎng)后洗滌細胞。根據(jù)mimics 轉染分為miR-494 組和對照組。miR-494組每孔加入100 pmol miR-494 mimics、2 ml 含血清DMEM 及5μl 轉染試劑；對照組每孔加入100 pmol陰性對照mimics、2 ml 含血清DMEM 及5μl 轉染試劑。轉染24 h 后進行后續(xù)實驗。

1.5 MTT 法

將MGC803 細胞分別轉染24 h、48 h、72 h 后按2×104個/孔的密度接種于96 孔板，每個時間點設置6個平行對照。培養(yǎng)過夜后加入MTT 溶液，再次避光培養(yǎng)4 h。吸凈上清液后每孔用150μl DMSO 溶液溶解MTT結晶。讀取酶標儀490 nm 處的光密度（optical density,OD）值。

1.6 流式細胞術

通過流式細胞儀檢測過表達miR-494 對MGC803 細胞周期及細胞凋亡的影響。將轉染72 h后的MGC803 細胞用冷PBS 洗2 次，胰酶消化后以800 r/min 離心5 min，獲取細胞沉淀，用PBS 緩沖液重懸細胞并調整細胞密度為5×106個/ml，取100μl細胞懸液與10μl 碘化丙啶（PI）溶液混合上機檢測細胞周期；取100μl 細胞懸液與5μl 及10μl PI 溶液混合上機檢測細胞凋亡。

1.7 Western blotting

采用放射免疫沉淀法提取細胞總蛋白，SDSPAGE 膠電泳分離蛋白，70 V 濕轉120 min 轉印目標蛋白至PVDF 膜上，室溫封閉2 h 后將目標條帶分別置入CyclinD1 和β-actin 一抗溶液中，在4℃下孵育過夜，用1∶5 000 稀釋的HRP 標記二抗，在室溫中孵育目標條帶1 h。采用ECL 法顯影，計算蛋白相對表達量。

1.8 免疫組織化學法

將甲醛固定、石蠟包埋的組織切片常規(guī)脫蠟、水化及微波抗原修復，分別用3%過氧化氫及10%山羊血清封閉切片。用PBS 溶液按1∶100 配制CyclinD1一抗工作液，覆蓋組織切片，4℃搖晃、孵育過夜。PBS 溶液洗凈未結合一抗后，使用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗結合相應一抗，用DAB 法顯示陽性蛋白。計算染色得分：無陽性染色細胞計0 分，＜25%計1 分，25%～＜50%計2 分，50%～＜75%計3 分，≥75%計4 分[7]。

1.9 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或重復測量設計的方差分析，相關性分析用Pearson 法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌與癌旁組織miR-494 相對表達量比較

癌旁組織miR-494 相對表達量為（1.327±0.052），胃癌組織為（0.921±0.048），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.421，P=0.000），癌旁組織較胃癌組織高。不同腫瘤直徑、TNM 分期患者的miR-494 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）不同性別、年齡，及是否吸煙、幽門螺桿菌感染、淋巴結轉移患者的miR-494相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理特征患者的miR-494 相對表達量比較（n =60，±s）

表1 不同臨床病理特征患者的miR-494 相對表達量比較（n =60，±s）

臨床病理特征 miR-494 t 值 P 值性別男0.871±0.037 1.295 0.062女0.931±0.065年齡≤60 歲 0.935±0.026 1.167 0.087＞60 歲 0.881±0.038吸煙是0.904±0.049 0.856 0.105否0.936±0.028幽門螺桿菌感染是0.933±0.019 0.738 0.211否0.909±0.024腫瘤直徑≤3 cm 0.975±0.031 1.844 0.041＞3 cm 0.722±0.046淋巴結轉移是0.884±0.055 1.660 0.059否0.939±0.032 TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期 0.949±0.027 1.969 0.028Ⅲ、Ⅳ期 0.836±0.059

2.2 miR-494 對MGC803 細胞增殖、細胞周期進展及凋亡的影響

對照組MGC803 細胞miR-494 相對表達量為（1.00±0.00），miR-494 組 為（11.23±3.87），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.031，P=0.000），對照組較miR-494 組低（見圖1），表明慢病毒感染促進MGC803 細胞miR-494 的表達。兩組轉染后24 h、48 h、72 h 的OD 值比較，經(jīng)重復測量設計的方差分析，結果如下：①不同時間點的OD 值比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=15.762，P=0.016）；②兩組的OD值比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=67.896，P=0.008），miR-494 組較對照組低，細胞活力較低；③兩組的OD 值變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=19.214，P=0.013）（見表2和圖2）。流式細胞術結果表明，對照組G0/G1期比例為（40.33±4.23）%，miR-494 組為（78.19±6.48）%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.721，P=0.023）（見圖3）；對照組細胞凋亡比例為（11.28±3.05）%，miR-494 組為（13.45±2.16）%，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（t=1.034，P=0.063）（見圖4）。

圖1 兩組miR-494 相對表達量比較 （±s）

表2 兩組不同時間點OD 值比較 （±s）

表2 兩組不同時間點OD 值比較 （±s）

組別 24 h 48 h 72 h對照組 0.176±0.011 0.463±0.031 0.814±0.032 miR-494 組 0.131±0.009 0.296±0.017 0.544±0.034

圖2 兩組不同時間點OD 值變化趨勢 （±s）

圖3 兩組G0/G1 期細胞的流式細胞圖

圖4 兩組凋亡細胞的流式細胞圖

2.3 miR-494 對MGC803 細胞中CyclinD1 表達的影響

對照組CyclinD1 mRNA 相對表達量為（1.00±0.00），miR-494 組為（0.41±0.13），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.031，P=0.011），對照組較miR-494 組高（見圖5），表明過表達miR-494 抑制CyclinD1 mRNA 的表達。對照組CyclinD1 蛋白相對表達量為（0.68±0.13），miR-494 組為（0.27±0.09），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.106，P=0.042），對照組較miR-494 組高（見圖6），表明過表達miR-494 下調CyclinD1 蛋白的表達。

圖5 兩組CyclinD1 mRNA 相對表達量比較 （±s）

圖6 兩組CyclinD1 蛋白相對表達量比較 （±s）

2.4 miR-494 與CyclinD1 的相關性

miR-494 與CyclinD1 免疫組織化學評分呈負相關（r=-0.469，P=0.009）。見圖7。

圖7 miR-494 與CyclinD1 免疫組織化學評分的相關性散點圖

3 討論

miR-494 首先被發(fā)現(xiàn)于人類視網(wǎng)膜母細胞瘤中，其在人類許多良惡性疾病中扮演重要角色。例如，抑制動脈粥樣硬化小鼠體內miR-494 的表達水平能夠提高斑塊的穩(wěn)定性[8]；高血清miR-494 水平與子宮內膜異位癥患者并發(fā)不孕關系密切[9]；低表達miR-494的乳腺癌患者預后不良[10]。但其在胃癌的表達及生物學功能尚未完全清楚。

本研究結果提示miR-494 在胃癌中扮演潛在抑癌角色，miR-494 能夠顯著抑制體外培養(yǎng)MGC803 細胞的增殖，阻礙細胞周期的進展。但是其對細胞凋亡的發(fā)生并無顯著影響。除此之外，筆者通過文獻查詢也發(fā)現(xiàn)，miR-494 對結直腸癌轉移及肺癌耐藥也具有調控作用[11-12]，說明miR-494 具有多樣性的抗腫瘤作用，值得進一步深入研究。

MicroRNA 能夠通過結合靶基因3’-UTR 區(qū)而發(fā)揮負向調控作用。結合上述功能學實驗結果及生物信息學分析結果發(fā)現(xiàn)，細胞周期蛋白CyclinD1 mRNA存在于miR-494 的結合位點，可能是miR-494 的潛在靶點之一。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，過表達miR-494 能下調CyclinD1 的表達，且在組織水平上，miR-494與CyclinD1 的表達呈負相關。CyclinD1 是調控細胞增殖和細胞周期的主要生物因子[13]。有研究指出，CyclinD1 的異常高表達與胃癌的進展密切相關[13]。因此，下調CyclinD1 的表達可能是miR-494 抑制胃癌細胞的關鍵機制之一。