袁輝 張淑敏 王得利 欒海蓉 石屹 徐吉雨

鈣敏感受體（calcium sensing receptor，CaSR）是G 蛋白偶聯(lián)受體超家族中C 家族成員，由1 078個(gè)氨基酸組成，包含四個(gè)主要區(qū)域：細(xì)胞外N 末端區(qū)域（ECD）、連接ECD 和第一跨膜的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域螺旋結(jié)構(gòu)、七個(gè)跨膜（TM）結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域[1-3]。廣泛表達(dá)于真核和原核細(xì)胞，其配體為多價(jià)陽離子和多胺等。具有維持機(jī)體鈣穩(wěn)態(tài)及其他金屬離子穩(wěn)態(tài)的功能[4-6]。本研究擬通過觀察CaSR 在裸鼠移植瘤模型和C-33A 細(xì)胞中的表達(dá)情況，通過給予CaSR 激動(dòng)劑（R568）、CaSR 抑制劑（Calhex231）干預(yù)，從而推斷CaSR 調(diào)控宮頸癌C-33A 細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞及分組 30 只5 周齡BALB/c雌性裸鼠（18±2）g 購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。造模采取裸右側(cè)腋下皮下注射C-33A 細(xì)胞懸混液（5.5×107個(gè)/mL）。按瘤體大小均勻分組：Model（移植瘤模型）組、Model+R568 組和Model+Calhex231 組，每組10 只，體重分別為（22.18±2.03）、（23.99±2.45）、（22.79±2.77）g，三組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Model+R568組和Model+Calhex231 組每日分別腹腔注射R568（10 μmoL/kg）和Calhex231（10 μmoL/kg）。SPF 級(jí)飼養(yǎng)1 個(gè)月，安樂死后主動(dòng)脈取血并分離取出移植瘤稱重。體積（mm3）=0.5×長徑×短徑2。抑瘤率=（Model 瘤重-Model+R568 組或Model+Calhex231 組瘤重）/Model 瘤重×100%。宮頸癌C-33A 細(xì)胞購自上海澤葉生物科技有限公司（貨號(hào)：AC102117）分為Control 組，R568（5 μmoL） 組，Calhex231（3 μmoL）組。

1.2 ELISA 法測(cè)定血清及培養(yǎng)基中MMP2 和MMP9含量 ELISA 測(cè)定試劑盒均購自Beyotime 公司，飼養(yǎng)4 周，取待測(cè)鼠血清（培養(yǎng)基）后，置于冰盒內(nèi)。在96 孔酶標(biāo)板中，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)蛋白孔、空白孔、對(duì)照孔和待測(cè)孔。按照廠家提供說明操作，顯色后使用酶標(biāo)儀，在450 nm 波長條件下檢測(cè)每個(gè)待測(cè)孔的OD 值，最后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式計(jì)算每組待測(cè)血清（培養(yǎng)基）中MMP2 和MMP9 濃度。

1.3 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 將研磨碎的瘤組織（C-33A 細(xì)胞）置于1.5 mL EP 管中加入0.5 mL RIPA緩沖液裂解，然后在4 ℃條件下離心（13 500 r/min，25 min），收集上清液并在-80 ℃下保存。使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（Beyotime，產(chǎn)品編號(hào)：P0023）檢測(cè)每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)濃度。應(yīng)用12.5%的SDSPAGE 電泳分離各組蛋白，而后將待測(cè)蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。在室溫下，用5%脫脂奶粉封閉2 h，用以下一抗（1︰1 000 稀釋，4 ℃）將膜孵育過夜：CaSR、Bax、Bcl-2、E-cadherin、β-catenin 和VEGFR3（Santa Cruz Biotechnology，Dallas，Texas，USA）。用抗鼠/兔IgG 抗體（1︰5 000 稀釋，北京藍(lán)博斯特生物有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：LBI01）室溫孵育1 h。采用ECL 法在化學(xué)發(fā)光儀上顯色，應(yīng)用Image J（v1.8 版本）圖像處理軟件測(cè)量條帶灰度值，計(jì)算各組的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 CCK8 檢測(cè)C-33A 細(xì)胞增殖和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) （1）按照實(shí)驗(yàn)步驟分組后，將C-33A 細(xì)胞接種于96 孔板（5×103/孔），設(shè)立空白對(duì)照組，觀察細(xì)胞狀態(tài)良好即可加藥處理，隨后繼續(xù)培養(yǎng)48 h（37 ℃，5%CO2）；取出96 孔板，用預(yù)冷PBS 洗滌3 次，把液體甩干后向每孔加入10 μL CCK-8溶液，封板后在37 ℃溫箱中孵育60 min，使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長范圍檢測(cè)每個(gè)待測(cè)孔的OD 值。（2）C-33A 細(xì)胞接種于6 孔板中（1×106），無菌條件下，在6 孔板背后畫6 條橫線，每條線間隔0.5 cm。棄掉培養(yǎng)基，PBS 清洗后用槍頭與所畫橫線成90°角劃過，隨后PBS 洗滌細(xì)胞3 次，分別加入加藥處理的培養(yǎng)基，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在0 h 和24 h 取出6 孔板應(yīng)用光學(xué)顯微鏡拍照。

1.5 Fluo 4-AM 熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣變化 將C-33A 細(xì)胞接種于24 孔板中（2.5×105/孔），分別加入加藥處理的培養(yǎng)基，24 h 后，用滅菌預(yù)冷的PBS 清洗3 次。在37 ℃避光條件下，加入HEPES溶液配置的Fluo 4-AM 工作液300 μL。30 min 后，每組選取8～10 個(gè)細(xì)胞為觀察對(duì)象，用熒光顯微鏡（Olympus Ⅸ-70）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣變化，激發(fā)波長480～500 nm，發(fā)射波長525～530 nm。

1.6 qRT-PCR 檢測(cè)Bax 和Bcl-2 基因表達(dá) 按照廠家提供的操作步驟，使用Trizol（Invitrogen，15596026）從各組C-33A 細(xì)胞中提取總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaqMan）以2 μg 的總RNA 合成cDNA。使用SYBR Green PCR 試劑盒（Applied Biosystems，USA）在Light Cycler?480 序列檢測(cè)系統(tǒng)（Roche Life Science，Germany） 上檢測(cè)Bax 和Bcl-2 的mRNA 表達(dá)水平。以β-actin 為內(nèi)參，根據(jù)待測(cè)基因和β-actin 循環(huán)數(shù)CT 值，按照公式相對(duì)值=2-△△CT計(jì)算相關(guān)表達(dá)。Bcl-2 上游引物：5′-CTTCCGTGATGGGGTCAACT-3′，下游引物：5′-AGGTACTCGGTCATCCAGG T-3′；Bax 上游引物：5′-ATGGACGGGTCCGGGGAGCA-3′，下游引物：5′-CCCAGTTGAAGTTGCCGTCA-3′，β-actin上游引物：5′-CCGGCTTCGCGGGCGACG-3′，下游引物：5′-TCCCGGCCAGCCAGGTCC-3′。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組移植瘤瘤重及體積的比較 30 d 后取各組裸鼠瘤組織稱重，Model 組移植瘤瘤重 為（345.14±22.33）mg，Model+R568 組為（231.43±21.24）mg，Model+Calhex231 組 為（415.37±30.01）mg，Model+R568 組的移植瘤瘤重低于Model 組，Model+Calhex231 組的移植瘤瘤重高于Model 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Model+R568 組的抑瘤率為（33.1±3.6）%。在飼養(yǎng)5、10、15、20、25、30 d，測(cè)量移植瘤體積，與Model 組比較，Model+R568 組顯著抑制腫瘤生長而Model+Calhex231 腫瘤體積顯著增加（P＜0.05），見表1、圖1。

表1 三組移植瘤體積的變化情況比較[mm3，（）]

表1 三組移植瘤體積的變化情況比較[mm3，（）]

圖1 三組移植瘤體積的變化情況比較

2.2 三組裸鼠血清中MMP2 和MMP9 含量比較 Model+R568 組的MMP2 和MMP9 水平均低于Model 組，Model+Calhex231 組的MMP2 和MMP9 水平均高于Model 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組裸鼠血清中MMP2和MMP9含量比較[ng/mL，（）]

表2 三組裸鼠血清中MMP2和MMP9含量比較[ng/mL，（）]

*與Model 組比較，P＜0.05。

2.3 三組移植瘤組織中CaSR、E-cadherin 和Bcl-2的表達(dá)情況比較 Western blot 測(cè)定結(jié)果顯示，分別以CaSR、E-cadherin 和Bcl-2 與β-actin 的比值為參數(shù)，與Model 組比較，Model+R568 組的CaSR 和E-cadherin 蛋白表達(dá)均顯著增加而Bcl-2 的表達(dá)量顯著減少，Model+Calhex231 組CaSR 和E-cadherin蛋白表達(dá)均顯著降低而Bcl-2 的表達(dá)量顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3、圖2。

2.4 C-33A 細(xì)胞在各組增殖和遷移情況比較 將Control 組指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化為1 后，與Control 組比較，R568 組細(xì)胞活力（0.55±0.04）和遷移速率（0.60±0.17）均顯著降低，而Calhex231 組細(xì)胞活力（1.38±0.17）和遷移速率（1.42±0.23）均顯著增加（P＜0.05）。C-33A 細(xì)胞遷移統(tǒng)計(jì)見圖3。

表3 三組移植瘤組織中CaSR、E-cadherin和Bcl-2的表達(dá)情況比較（-x±s）

圖2 三組移植瘤組織中CaSR、E-cadherin和Bcl-2的表達(dá)情況比較

圖3 C-33A細(xì)胞在三組中的遷移情況比較

2.5 三 組CaSR、Bax、E-cadherin、β-catenin、Bcl-2 和VEGFR3 在C-33A 細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況比較 分別以CaSR、Bax、E-cadherin、β-catenin、Bcl-2 和VEGFR3 與β-actin 的比值為參數(shù)，與Control 組比較，R568 組CaSR、Bax、E-cadherin 和β-catenin 蛋白表達(dá)均顯著增加而Calhex231 組上述蛋白表達(dá)均顯著減少，Bcl-2 和VEGFR3 表達(dá)趨勢(shì)與上述結(jié)果相反，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4、表4。

圖4 三組CaSR、Bax、E-cadherin、β-catenin、Bcl-2和VEGFR3在C-33A細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況比較

2.6 三組C-33A 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及細(xì)胞培養(yǎng)基中MMP2 和MMP9 含量變化情況比較 熒光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control 組比較，R568 組Ca2+濃度顯著增加而Calhex231 組Ca2+濃度顯著下降，見表5、圖5。ELISA 檢測(cè)培養(yǎng)基中，與Control 組比較，R568 組MMP2 和MMP9 含量均顯著降低而Calhex231 組均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表6。

表4 三組CaSR、Bax、E-cadherin、β-catenin、Bcl-2和VEGFR3在C-33A細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況比較（）

表4 三組CaSR、Bax、E-cadherin、β-catenin、Bcl-2和VEGFR3在C-33A細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況比較（）

*與Control 組比較，P＜0.05。

表5 三組C-33A細(xì)胞內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)Ca2+濃度比較（）

表5 三組C-33A細(xì)胞內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)Ca2+濃度比較（）

表5（續(xù)）

圖5 三組C-33A細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度比較

表6 三組C-33A細(xì)胞培養(yǎng)基中MMP2和MMP9含量比較[ng/mL，（）]

表6 三組C-33A細(xì)胞培養(yǎng)基中MMP2和MMP9含量比較[ng/mL，（）]

*與Control 組比較，P＜0.05。

2.7 三組C-33A 細(xì)胞中Bcl-2 和Bax 基因表達(dá)情況比較 qRT-PCR 檢測(cè)顯示，與Control 組比較，R568 組Bax 基因表達(dá)顯著增加而Calhex231 組表達(dá)顯著減少，Bcl-2 基因表達(dá)量與上述結(jié)果相反（P＜0.05），見表7。

3 討論

癌癥是當(dāng)今醫(yī)學(xué)最為關(guān)注的疾病之一。根據(jù)WHO 官方數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018 年全球新增1 810 萬癌癥病例，死亡人數(shù)達(dá)960 萬，其中男、女患病比率接近1︰1，死亡比率1︰0.89?？梢?，女性和男性同樣遭受著腫瘤的侵害和困擾[7-9]。宮頸癌是女性最為常見的腫瘤之一，其死亡率在我國一直居高不下。當(dāng)今醫(yī)療策略為早期發(fā)現(xiàn)早期治療效果最好，5 年生存率約65%以上，而晚期和復(fù)發(fā)性宮頸癌治療效果極差[10]。宮頸癌目前主要治療手段仍為化療和手術(shù)治療，但副作用和手術(shù)創(chuàng)傷嚴(yán)重，可見，明確其發(fā)病機(jī)制和研發(fā)有效靶點(diǎn)藥物才是關(guān)鍵所在[11]。CaSR 是G 蛋白偶聯(lián)受體超家族中C 家族成員，在細(xì)胞分泌、增殖、分化、趨化、凋亡、基因表達(dá)、維持膜電位、離子通道開關(guān)、衰老和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[12]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)[12-14]已證實(shí)，CaSR 參與心肌缺血再灌注損傷、糖尿病心肌病、心肌梗死和消化道腫瘤等。

表7 三組C-33A細(xì)胞中Bcl-2和Bax基因表達(dá)情況比較（）

表7 三組C-33A細(xì)胞中Bcl-2和Bax基因表達(dá)情況比較（）

*與Control 組比較，P＜0.05。

本文為了檢驗(yàn)CaSR 表達(dá)在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，筆者制備了C-33A 細(xì)胞移植瘤模型。結(jié)果顯示，R568（CaSR 激動(dòng)劑）對(duì)腫瘤的生長有明顯抑制作用。給予裸鼠移植瘤模型組加入Calhex231（CaSR抑制劑）后，移植瘤生長速度明顯增加，由此推斷CaSR 可能參與此過程。MMP2 和MMP9 為基質(zhì)金屬蛋白酶家族主要成員，其不僅能夠破壞基底膜而且能促進(jìn)腫瘤組織周圍血管形成，為腫瘤生長、腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲提供便利條件[15-16]。ELISA 檢測(cè)血清和C-33A 細(xì)胞培養(yǎng)基結(jié)果顯示，R568 能夠有效降低MMP2 和MMP9 含量水平，而Calhex231 作用相反。CCK-8 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)?zāi)芊謩e反映細(xì)胞的增殖和遷移情況。在實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)R568 有明顯抑制C-33A 細(xì)胞增殖和遷移的作用。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)腫瘤細(xì)胞中E-cadherin 和β-catenin 蛋白形成復(fù)合體后[17-18]，能夠增加腫瘤細(xì)胞黏附性使細(xì)胞增殖和遷移減慢；過度的VEGFR3表達(dá)能夠增加腫瘤周圍血管形成，進(jìn)而供給其充足的生長血運(yùn)，從而促進(jìn)其生長和侵襲[19-20]。為明確CaSR 激活后抑制宮頸癌C-33A 細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制，筆者分別檢測(cè)了瘤組織和細(xì)胞中CaSR、Bax、Bcl-2、E-cadherin、β-catenin 和VEGFR3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，R568 能夠上調(diào)CaSR、Bax、E-cadherin 和β-catenin 的蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2 和VEGFR3 蛋白表達(dá)，Calhex231 有上述相反作用。這一結(jié)果和C-33A 細(xì)胞中Bcl-2 和Bax 基因表達(dá)趨勢(shì)完全一致。此外，檢測(cè)C-33A 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化趨勢(shì)與CaSR 表達(dá)也相一致。

綜上，據(jù)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推斷如下，CaSR 激活后可增加C-33A 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，一方面促進(jìn)E-cadherin 和β-catenin 蛋白表達(dá)并形成復(fù)合物，增加腫瘤細(xì)胞黏附性從而抑制細(xì)胞增殖和遷移；另一方面，抑制VEGFR3 表達(dá)能夠減少腫瘤周圍血管形成，阻止其生長和侵襲。此外，Ca2+濃度升高也可激活促凋亡基因表達(dá)誘導(dǎo)C-33A 細(xì)胞凋亡，然而，詳細(xì)分子調(diào)控機(jī)制還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)逐一證實(shí)。