張佳旭，郭新月，李曉亮，林曉婷，李嘉楠，楊柳

(黑龍江中醫(yī)藥大學北藥基礎與應用研究省部共建教育部重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身性骨代謝性疾病,以骨量丟失和骨組織微觀結構的損傷為特點[1]。目前公認的OP發(fā)病機制之一是破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞(osteoblast，OB)介導的骨形成之間的動態(tài)平衡被打破,導致骨吸收大于骨形成,骨量下降[2]?，F(xiàn)階段，在治療OP的藥物中，促進骨形成的藥物只有甲狀旁腺激素是被美國食品藥物管理局唯一批準的[3]。但是甲狀旁腺激素由于可能會導致骨肉瘤,這使甲狀旁腺激素的臨床使用受到了限制[4]。OB主要由內(nèi)外骨膜和骨髓中基質(zhì)內(nèi)的間充質(zhì)始祖細胞分化而來，能特異性分泌多種生物活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)并影響骨的形成和重建過程[5]。OB參與了骨基質(zhì)成分如Ⅰ型膠原的產(chǎn)生，在骨質(zhì)代謝調(diào)節(jié)中起著關鍵作用[6],此外還具有影響鈣離子和磷酸鹽在骨化中心濃聚并誘導骨基質(zhì)成分礦化的功能，以及會產(chǎn)生與體內(nèi)基質(zhì)礦化有關的骨鈣蛋白、骨橋蛋白和骨唾液酸糖蛋白[7]。因此OB的生長、分化和活性的改變在一些骨科發(fā)病機制中起著重要作用。

牛膝，為莧科植物牛膝(RAB)的干燥根。冬季莖葉枯萎時采挖，除去須根和泥沙，捆成小把，曬至于皺后，將頂端切齊，曬干。分布于全國，在有些地區(qū)有大量栽培品種[8]。具有逐瘀通經(jīng)、補肝腎、強筋骨、利尿通淋、引血下行的功能。用于經(jīng)閉、痛經(jīng)、腰膝酸痛、筋骨無力等。《名醫(yī)別錄》中記載RAB“療傷中少氣，男子陰消，老人失溺，補中續(xù)絕，益精利陰氣，填骨髓，止發(fā)白，除腦中痛及腰脊痛，婦人月水不通，血結?！盧AB是補肝腎、強筋骨之要藥，既往研究也表明RAB具有抗骨質(zhì)疏松的作用，RAB當中的甾體對于OB的增殖與分化也有很大的影響，但是RAB對OB影響的潛在在分子機制仍然有待于具體研究[9]。

網(wǎng)絡藥理學是近年來新興的一門學科，它基于前沿的科學研究成果和文獻資料，以“疾病-基因-靶標-藥物”概念為基礎，以系統(tǒng)、綜合的觀點看待藥物對疾病網(wǎng)絡的干預和作用，從而揭示藥物對人體的復雜的作用機制[10-11]。這與中藥多成分、多途徑、多靶點協(xié)同作用的機制是高度統(tǒng)一的[12]。因此，本文借助網(wǎng)絡藥理學的方法，探討RAB對于OB影響的潛在可能機制，為今后的RAB現(xiàn)代藥理研究以及骨科疾病的靶向藥物研究提供一定的參考依據(jù)和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

數(shù)據(jù)庫：TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、UniProt(https://www.uniprot.org)、Gene Cards(https://www.genecards.org/)、Dig See(https://omictools.com/digsee-tool)、OMIM(https://www.omim.org)、String(https://string-db.org/cgi/input.pl)、DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)。

軟件：在線Venn圖繪制工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)、Cytoscape、R、RStudio。

1.2 方法

1.2.1 活性成分的篩選與活性成分靶點的預測

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索RAB當中的化學成分，篩選出口服利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%，藥物相似性(Drug-likeness,DL)≥0.18的化學成分作為RAB的主要活性成分。結合文獻查閱結果，整理添加符合要求的化合物。對其候選化合物名稱進行檢索并整理對應的靶蛋白。將整理好的靶蛋白導入到UniProt數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo Sapiens”，獲取每個靶蛋白所對應的靶基因，最后將得到的靶基因進行合并，保留唯一項，所得結果即為RAB活性成分的靶點。

1.2.2 拓撲網(wǎng)絡的構建

以“osteoblast”為關鍵詞在Gene Cards、Dig See以及 OMIM數(shù)據(jù)庫中查找與成骨蛋白相關的靶點，合并3個數(shù)據(jù)庫的檢索結果。將上述得到的靶點和檢索結果經(jīng)過在線Venn圖繪制工具映射獲得RAB影響OB的潛在作用靶點。建立活性成分-作用靶點相互作用數(shù)據(jù)庫，并導入到Cytoscape軟件中，構建RAB影響OB蛋白拓撲網(wǎng)絡圖。

1.2.3 RAB影響OB關鍵靶點分析

為了進一步研究RAB影響OB的可能作用機制，將RAB的作用靶點導入到 String數(shù)據(jù)庫中,限定研究物種為“Homo Sapiens”, 選擇可信度最小值為0.900，獲得蛋白互作關系，將所得數(shù)據(jù)文件導入到Cytoscape中，構建蛋白互做網(wǎng)絡圖，得到RAB影響OB的關鍵靶點。

1.2.4 基因富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對潛在靶點進行GO(Gene ontology)功能富集分析，研究RAB影響OB的主要生物功能；對潛在的靶點進行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析，研究RAB影響OB主要信號通路。將獲得的富集結果利用R語言對主要生物功能進行可視化分析。

2 結果

2.1 活性成分的篩選與活性成分靶點的預測

結合文獻和數(shù)據(jù)庫的檢索結果，得出符合條件的化學成分主要包括β-蛻皮甾酮(β-ecdysterone)、牛膝苷(bidentatoside)、刺苷A(Spinoside A)、小檗堿(berberine)和漢黃芩素(wogonin)等20個化學成分。之后利用TCMSP進行靶標預測并篩選，得到RAB活性成分靶點主要包括前列腺素G/H合酶2(Prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)、核受體輔激活劑2(Nuclear receptor coactivator 2，NCOA2)、激素受體(Androgen receptor，AR)、孕激素受體(Progesterone receptor，PGR)和5亞基鈉通道蛋白(Sodium channel protein type 5 subunit alpha，SCN5A)等254個。

2.2 拓撲網(wǎng)絡的構建

在Gene Cards等數(shù)據(jù)庫得到OB的相關基因92 370個，經(jīng)在線Venn圖處理得到RAB靶點與影響OB的靶點的共有基因204個，即為RAB影響OB的潛在作用靶點。Venn圖見圖1。將虛擬選出的候選化合物和靶點預測得到的靶點基因輸入Cytoscape軟件構建藥物-活性成分-作用靶點-細胞網(wǎng)絡，得到圖2。根據(jù)網(wǎng)絡拓撲學原理根據(jù)度值由大到小對篩選出的化合物進行分析，詳細的信息見表1。

圖1 潛在作用靶點Venn圖

注：該網(wǎng)絡包括220個節(jié)點，602條邊，其中204個節(jié)點為RAB作用于OB的靶點，網(wǎng)絡中表示為黃色，14個節(jié)點為RAB作用于OB有直接作用關系的活性成分，在網(wǎng)絡中表示為藍色，紅色菱形表示為藥物和疾病。

表1 RAB影響OB的主要化合物

2.3 RAB影響OB的關鍵靶點

將上面所得的204個潛在可能靶點上傳至String數(shù)據(jù)庫，將上述條件刪選之后得到結果導入Cytoscape構建蛋白互作網(wǎng)絡圖，見圖3。由于潛在靶點數(shù)目過多，根據(jù)度值大小選擇度值大于10的前52個靶點進行分析，得到RAB影響OB關鍵蛋白互作網(wǎng)絡圖，見圖4。其中轉(zhuǎn)錄因子AP(JUN)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、腫瘤蛋白p53(TP53)、轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)、腫瘤壞死因子(TNF)、RAC-alpha serine/threonine-protein kinase(AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、原癌基因c-Fos(FOS)和原癌基因蛋白(MYC)是排名前10的關鍵靶點。度值越大表明蛋白質(zhì)在蛋白互作網(wǎng)絡中的影響程度越大，參與的生物功能越多，這也可能是RAB影響OB的關鍵靶點。

注：該網(wǎng)絡包括159個節(jié)點，692條邊，圓圈由大變小，顏色由深變淺，度值相應由大變小，邊的粗細表示連接評分，鏈接評分越高，邊越粗。

注：該網(wǎng)絡包括52個節(jié)點，318條邊，圓圈由大變小，顏色由深變淺，度值相應由大變小，邊的粗細表示連接評分，鏈接評分越高，邊越粗。

2.4 基因富集分析結果

將上述潛在靶蛋白上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫并進行GO注釋及KEGG信號通路的富集分析。其中得到生物過程(Biology Process，BP)條目616個，根據(jù)P值大小排名前10的分別是DNA模板轉(zhuǎn)錄(transcription,DNA-templated)、信號傳導(signal transduction)、藥物反應(response to drug)、DNA模板化轉(zhuǎn)錄正調(diào)控(positive regulation of transcription,DNA-templated)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、基因表達的正調(diào)控(positive regulation of gene expression)、細胞增殖的正調(diào)控(positive regulation of cell proliferation)、凋亡過程的負調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)、炎癥反應(inflammatory response)和凋亡過程(apoptotic process)。細胞組成(cellular component，CC)條目71個，根據(jù)P值大小排名前10的分別是質(zhì)膜(plasma membrane)、細胞核(nucleus)、核質(zhì)(nucleoplasm)、線粒體(mitochondrion)、膜(membrane)、細胞外空隙(extracellular space)、胞外區(qū)(extracellular region)、胞外體(extracellular exosome)、胞液(cytosol)和細胞質(zhì)(cytoplasm)。分子功能(Molecular Function，MF)條目分別為130個，根據(jù)P值大小排名前10的分別是鋅離子結合(zinc ion binding)、序列特異性DNA結合轉(zhuǎn)錄因子活性(transcription factor activity, sequence-specific DNA binding)、序列特異性DNA結合蛋白(sequence-specific DNA binding)、蛋白質(zhì)同源二聚化活性(protein homodimerization activity)、蛋白質(zhì)異構化活性(protein heterodimerization activity)、蛋白質(zhì)結合(protein binding)、同蛋白結合(identical protein binding)、酶結合(enzyme binding)、DNA結合(DNA binding)和ATP結合(ATP binding)。KEGG通路分析得到129個代謝通路，根據(jù)P值大小排名前10的分別是腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、癌癥中的蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、前列腺癌(Prostate cancer)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、癌癥的通路(Pathways in cancer)、小分子核糖核酸在癌癥通路(MicroRNAs in cancer)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、甲型流感(Influenza A)、HTLV-Ⅰ感染(HTLV-Ⅰ infection)乙型肝炎(Hepatitis B)等通路。每個模塊的前10位條目見圖5，KEGG通路的詳細信息見表2。

表2 KEGG通路分析結果

注：圖A表示BP功能富集分析結果，圖B 表示CC功能富集分析結果，圖C表示MF功能富集分析結果，圖D KEGG通路分析結果。其中氣泡的大小代表與OB相關性以及涉及到該通路的基因數(shù)，顏色代表的富集顯著性。

2.5 構建網(wǎng)絡拓撲圖

整合RAB化學成分-靶點網(wǎng)絡、關鍵靶點PPI網(wǎng)絡以及上述可能參與到影響OB調(diào)節(jié)過程的前10條KEGG信號通路等信息，利用Cytoscape軟件構建“化學成分-OB-KEGG 信號通路”多維網(wǎng)絡，見圖6。

注:該網(wǎng)絡包括72個節(jié)點，308條邊，其中紅色菱形表示RAB當中主要化學成分，黃色倒三角表示KEGG通路信息，綠色圓圈表示影響OB關鍵靶點。

3 討論

OP是由于多種原因?qū)е碌墓敲芏群凸琴|(zhì)量下降，骨微結構破壞，造成骨脆性增加，從而容易發(fā)生骨折的全身性骨病,在老年人群中的發(fā)病率較高[13]。OB由于其特性，被認為是治療OP的一個突破口。本文應用網(wǎng)絡藥理學方法對RAB影響OB的作用機制進行初步研究，構建了RAB化學成分-OB-KEGG 信號通路網(wǎng)絡，系統(tǒng)性揭示了RAB影響OB的物質(zhì)基礎和分子機制。其中槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、β-谷甾醇、黃芩素5個化合物在網(wǎng)絡中的度值較大，可能是影響OB的關鍵化合物。但是不容忽視的是槲皮素、山柰酚兩種化合物在中草藥中分布較廣，這可能不是RAB具有強筋骨特性的關鍵物質(zhì)。并且由于目前對于RAB當中的β-蛻皮甾酮的研究比較少，所以導致其靶蛋白靶基因的數(shù)據(jù)相對較少，因而在網(wǎng)絡中沒有顯示出來。并且，姜濤等人通過細胞實驗發(fā)現(xiàn)對β-蛻皮甾酮能夠顯著促進OB的增殖以及分化，牛膝甾酮能夠通過上調(diào)OB分化相關基因及刺激自噬體的形成而促進其的分化[14-15]。這說明β-蛻皮甾酮和牛膝甾酮也可能是RAB治療OP的主要活性成分之一。

MAPK是信號從細胞表面?zhèn)鲗У郊毎藘?nèi)部的重要傳遞者[16]。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)-MAPK是連接細胞表面和細胞核以控制細胞增殖和分化的重要途徑[17]。既往研究顯示MAPK對OB的增殖、凋亡及分化有著重要的作用[18-21]。MAPK的激活被證明可以刺激跨基因動物OB的分化，并在不影響細胞增殖的情況下加速發(fā)育胚胎的骨積累[22]。相反，主導陰性MAPK抑制會減緩細胞培養(yǎng)中OB的分化，延緩骨發(fā)育[23]。在本研究中，RAB可能通過MAPK的三種亞型MAPK1、MAPK8、MAPK14來達到調(diào)節(jié)OB增值分化的目的，并且這一影響很可能是通過MAPK信號通路實現(xiàn)的。MAPK信號通路是經(jīng)典信號通路之一，有三級的信號傳遞過程：MAPK、MAPK激酶(MEK或MKK)以及MAPK激酶的激酶(MEKK或MKKK)。這三種激酶能依次激活，共同調(diào)節(jié)著細胞的生長、分化、應激、炎癥反應等多種重要的生理、病理效應[24]。大量的研究證明，MAPK信號通路對于OB和破骨細胞的平衡有很大的影響[25]。

TNF是由活化的單核巨噬細胞產(chǎn)生，對腫瘤細胞具有殺傷和抑制作用，同時還有抗感染的作用[26]。TNF細胞被認為是p38的誘導性因子，與MSCs和MC3T3中IL6的合成有關[27]。研究表明TNF小鼠通過p38抑制BMP2成骨[28]?；瘜W抑制p38可恢復由BMP-2觸發(fā)的RUNX2和其他成骨標志物的表達水平[28]。TNF介導的p38激活也與Rankl的早期表達有關，但與晚期表達無關[29]。宋獻美等人研究表明RAB通過逆轉(zhuǎn) TH17/Treg的失衡、可以抑制TNF的分泌[30]。因而RAB可能通過抑制TNF的分泌來影響p38從而改變OB的增值分化，這可能是RAB影響OB的分子機制之一。腫瘤壞死因子信號通路在這當中的作用也有待于被挖掘。

綜上所述，RAB影響OB具有多成分-多靶點-多途徑的特點，其主要通路不僅直接參與骨細胞的增殖、分化及凋亡，調(diào)節(jié)成骨、破骨代謝平衡，還通過調(diào)節(jié)免疫、炎癥、自噬等干預OB的功能，影響骨微環(huán)境。但本研究只是在分子機制上進行的預測探討，具體藥物作用機制仍需進一步實驗驗證。